人教版新课标选修44pcr讲解课件.pptVIP

实验一、聚合酶链式反应－PCR 一、实验原理： PCR又称聚合酶链式反应，是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由 高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温下， 待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温情况下，两 条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在 Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原 料，Mg2+存在下，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链 的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链 DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模 板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍， PCR产物得以指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因 扩增数百万倍。 １．DNA模板：反应中DNA量在50ng～200ng左右。且DNA纯度较 高， 以增加反应特异性。 ２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。 ３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低 Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。 ４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基 左右；G+C含量在40％－70％之间；引物内部不能有回该 序列；引物３’端不能互补。