生物工程下游技术第五章教程.pptVIP

将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。 此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。 7、其他方法 X-press法 振荡珠击破碎法 (Skaking Bead) 将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积, 用6500RPM振荡机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可.此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法. 一台机器最多可以在一天处理2400支样品.对小量且多样的人很方便. （4）两种方式的比较 高压匀浆法同高速珠磨法相比各有特点，前者操作参数少，易于确定，后者操作参数多，一般凭经验估计，并且玻璃珠之间的液体损失使一次处理85ml悬浮液最终只能得到50ml左右的浆液。 连续操作时，珠磨机兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活的可能性，而高压匀浆器配备换热器进行级间冷却。 珠磨机法破碎在适当条件下一次操作就能达到较高的破碎率，而高压匀浆往往需循环2-4次才行。 几乎所有种类的微生物细胞都可以用珠磨机破碎，包括含有包涵体的基因工程菌。 3、超声波破碎法（ultrasonication） 超声波破碎法利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。 （1）作用机理 声频高于15～20kHz的超声波在高强度声能输入可以进行细胞破碎，其破碎机理尚未清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。 空化现象是在强声波作用下，让气泡形成，胀大和破碎的现象。 超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。 在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。 空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。 超声波破碎法（Ultrasonication） 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差， 该法在实验室小规模细胞破碎中常用。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。 (2)动力学方程 （3）存在的问题 超声破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品是操作简便，液量损失少。 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感活性物质变性失活，噪声令人难以忍受，而且大容量装置声能传递，散热均有困难，因而超声破碎的应用潜力有限。 电声超声波发生器 非机械法 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方式称为渗透法。 4.化学渗透法（Chemical permeation） （1）作用机理 化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。 不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。 处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。 （1）EDTA作为螯合剂 能溶解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。 溶解细胞膜的磷脂层 甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。 （2）有机溶剂 如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。 （3）表面活性剂----Triton X-100 可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。 盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。 （4）变性剂 不同细胞可采用的化学渗透处理方式 细胞类型 变性剂 清洁剂 有机溶剂 酶 抗生素 生物试剂 螯合剂 革兰氏阴性细菌 * * * * * * 革兰氏阳性细菌