蛋白质组学Proteomics温州医科大学.ppt

* * * * * 2-DE 的缺点 难以有效分离极酸、极碱性蛋白质，极大、极小蛋白质，及低丰度蛋白质。 胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱实现自动化联用。 * 新型非凝胶技术 液相色谱法（liquid chromatography, LC） 对在双向电泳中难以分离鉴定的高分子量、低分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋白进行有效的分离鉴定。 LC-MS/MS：液质联用技术 * Cell culture Protein extraction 2-DE staining ? Image analysis Scanning * 微量测序（microsequencing） N-末端 Edman 降解：经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上 → N末端氨基酸残基经苯异硫氰酸酯修饰 → 从多肽链上切下修饰的残基 → 再经层析鉴定 → 余下的多肽链被回收再进行下一轮降解循环。 缺点：过程缓慢，消耗大，试剂昂贵。 * 质谱分析（Mass spectrometry） 基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）差异来分离并确定样品分子量。 * Inlet Ionization Mass Analyzer Mass Sorting (filtering) Ion Detector Detection Ion Source ? Solid ? Liquid ? Vapor Detect ions Form ions (charged molecules) Sort Ions by Mass (m/z) 1330 1340 1350 100 75 50 25 0 Mass Spectrum * 主要质谱类型 MALDI-TOF MS: 基质辅助激光解析吸附电离飞行时间质谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) ESI MS: 电喷雾质谱（ electrospray ionisation mass spectrometry ） * 基质辅助激光解析吸附电离飞行时间质谱 利用固体基质分子均匀包埋样品分子，在激光照射下，基质分子吸收激光能量而蒸发，携带样品分子进入气相，进一步将能量传递给样品分子，从而实现样品分子离子化。 * * * * MALDI 最大的特点是离子电荷通常为1-2个，而不象ESI中为多电荷离子，对分子质量较大的样品而言，不会形成复杂的多电荷图谱，因而对图谱的解析比较清楚。 * ESI 待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口。在高电压作用下形成带电荷的雾滴，随着雾滴中溶剂的蒸发，其表面电场随半径减少而增加，电荷密度不断变大，到达某一临界点时，样品以离子方式蒸发进入气相，从而实现离子化。 * 没有直接的外界能量作用于分子，因此对分子结构破坏较少，是一种典型的“软电离”方式。 可形成多电荷离子，因此在较小的m/z范围内可以检测到大分子质量的分子。采用电喷雾质谱目前可测定分子质 量100 kDa以下的蛋白质，最高可达150 kDa。 由于采用液相方式进样，可与蛋白质化学中常用的液相色谱联用，即液相色谱-电喷雾质谱 (LC-ESI MS)。 在常规电喷雾质谱中，喷雾的过程易形成较大液滴，液 滴中的样品分子在离子源就不能完全离子化，从而降低 了样品的利用率和灵敏度。 电喷雾源(ESI)的特点 * 鉴定与注释蛋白质的路线 通过肽指纹图谱（peptide mass fingerprint, PMF）和数据库搜寻匹配 通过检测样品中部分肽段的二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配 MALDI-TOF/TOF LC-MS/MS * 一 、肽质量指纹图谱法 基本过程为：蛋白质混合物样品经过2-DE分离后，从胶上切下需要鉴定的蛋白质斑点，用胰蛋白酶进行水解，胰蛋白酶在特定位点切割蛋白质，形成长短不一的多肽混合物，用MALDI-TOF质谱仪对多肽混合物进行质量分析，得到肽片段质谱图，一个质谱峰代表一种肽片段离子。由于各种蛋白质的一级结构不同，胰酶水解后产生的肽片段数目及质量均不相同，具有特征性，因此将得到的肽片段质谱图称为PMF。下图为卵白蛋白PMF： * * * 二 、肽序列标签鉴定法 蛋白质由20种氨基酸组，在蛋白质上随意选取一个四肽序列，根据概率论计算，另一个蛋白质上出现相同四肽序列的概率为1/204，即1/160,000，因此从理论上说，只要测定一个蛋白质中5~6个氨基酸残基的序列，就足以作为鉴别蛋白质的特异性标签，称为肽序列标签。 * School of Laboratory Medicine