第二章植物新品种来源文档.pptVIP

* 分子标记辅助选择育种 * 基于DNA-DNA杂交的DNA标记 基于PCR技术的DNA标记 基于限制性酶切和PCR的DNA标记 基于单个核苷酸多态性的DNA标记 DNA标记 一、分子标记的类型 * RFLP即限制性片段长度多态性。这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。 特定的DNA／限制性内切酶组合所产生的片段是特异的，它能作为某一DNA的特有“指纹”，直接反映了生物的遗传多态性。 （一）RFLP标记 限制性内切酶是一种能识别DNA上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA分子的酶。长度一般在4至8个碱基对之间。 限制性内切酶，如PstⅠ的限制性位点是（其中箭头表示被切开的位置）： 5’ C TGCA↓G 3’ 3’ G↑ACGT C 5 * RFLP原理示意图 * 探针 单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆作为 探针 植物基因组 酶解、电泳 电泳谱带连续分布 Southern杂交 * 1、RFLP标记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点。 2、RFLP技术的实验操作过程较复杂，需要对探针进行同位素标记，即使应用非放射性的Southern杂交技术，仍然是个耗时费力的过程。  共显性 条带大小变化 显性 条带有无 无法区分纯合显性和杂合 P1 P2 F1 P1 P2 F1 RFLP特点 * （二）RAPD标记 (随机扩增的多态性DNA ) * 1、引物长度较短，通常为9～10个碱基，大约只有常规的PCR引物长度的一半，使用较低的退火（DNA复性）温度，以保证引物能与模板DNA结合。 2、揭示DNA多态性的能力高；通常每次PCR反应只使用一种引物，将2种引物组合使用，寻找更多标记。 3、由于引物较短，RAPD标记的PCR易受实验条件的影响，结果的重复性较差。一般表现为显性遗传，不能区分显性纯合和杂合基因型，因而提供的信息量不完整。 RAPD标记特点 * SSR分布在基因组的不同位置上，基本重复单元由几个核苷酸组成的，重复次数一般为10～50 （三）SSR标记 每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列 根据两侧序列设计一对特异引物来扩增SSR序列。 基本单元重复次数的不同， 形成SSR座位的多态性。 * 检测SSR标记的关键在于寻找SSR座位两侧的核苷酸序列的特异保守区，设计出一对特异的PCR引物。 1、开发SSR引物序列 2、通过Genbank、EMBL和DDBJ等DNA序列数据库搜索SSR序列，省去构建基因文库、杂交、测序等繁琐的工作。 * 开发SSR引物序列示意图 建立DNA文库 酶切 杂交 阳性克隆 测序 设计引物 * 用两种能产生粘性末端的限制性内切酶将基因组DNA切割成分子量大小不等的限制性片段 （四）AFLP标记(扩增片段长度多态性 ) 将这些片段和与其末端互补的已知序列的接头连接 引物5’端与接头和酶切位点序列互补，3’端在酶切位点后增加1～3个选择性碱基 确保只有一定比例的限制性片段 被选择性地扩增，经变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳分辨。 * 1、AFLP揭示的DNA多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异。扩增片段的谱带数取决于采用的内切酶及引物3’端选择碱基的种类、数目和所研究基因组的复杂性。 2、AFLP是限制性酶切与PCR结合的一种技术，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性，可以在一个反应内检测大量限制性片段，一次可获得50～100条谱带的信息。 3、主要不足：相对比较费时耗财。 AFLP标记特点 * 1、单核苷酸多态性(SNP) 是指在基因组上单个核苷酸的变异；一般而言,SNP 是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP。 （五）SNP标记特点 * 2、SNP在CG序列上出现最为频繁,而且多是C转换为T ,原因是CG中的C常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。 3、SNP在基因组内可以划分为两种形式: （1）遍布于基因组的大量单碱基突变； （2）基因编码区的功能性突变, 经常引起表达蛋白的多态性变异, 有时会影响他们的功能特性。 4、SNP 在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的： （1）SNP在非转录序列要多于转录序列； （2）在转录区非同义突变(有氨基酸序列的改变)的频率, 比其他方式突变的频率低得多。 * 1、在DNA测序过程中，利用碱基的峰高和面积的变化来监测单个核苷酸的改变引起的DNA多态性； 鉴定SNP标记的主要途径 * 2、最直接的方法，通过设计特异的PCR引物扩增某个特定区域的DNA片段，通过测序和遗传特征的比较，来鉴定该DNA片段是否可以作为SNP标记； 3、通过对已有数据