人胚不同脑区神经前体细胞的体外分离培养及分化特性比....docVIP

人胚不同脑区神经前体细胞的体外分离培养及分化特性比较的研究 华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室 430030 桂伶俐 张传汉 祝畅 刘志恒 目的 比较人胚胎不同脑区来源并体外成功分离、培养的神经前体细胞的生长及分化特性。 方法 取胎龄11～12 周水囊引产胎儿不同脑区：皮质、纹状体、丘脑、中脑、桥脑、延髓细胞,吹打、过滤制成单细胞悬液，并以105～106/ml的细胞密度接种。用含人表皮生长因子(h-EGF) 、人碱性成纤维细胞生长因子(h-bFGF)、人白细胞抑制因子(h-LIF)及B27的neurobasal培养液离体悬浮培养。待形成典型的神经球样物质后，鉴定其巢蛋白（nestin）抗原的表达及增殖能力；并撤掉各类生长因子以1 %胎牛血清( FBS)诱导分化,采用免疫荧光技术观察其分化潜能。观察不同脑区来源的神经前体细胞同一时点形成神经球的形态及数量，并利用免疫荧光比较各组分化成的神经元及星形胶质细胞占总细胞的比例。 结果 皮质、纹状体、丘脑、延髓原代培养中,可见悬浮生长并渐增大的细胞球。将球吹打传代后,又有新的细胞球生成。其nestin抗原阳性，经5’溴-2-脱氧尿苷（BrdU）预培养后其免疫荧光染色显示为阳性。取细胞球诱导分化,则见细胞从球迁出、伸出突起并渐分支,细胞MAP2、GFAP 等标志性抗原免疫荧光染色均为阳性。据此，可鉴定其为神经前体细胞。体外培养第3、4天，纹状体及丘脑原代培养中分别可见桑椹样神经球，且纹状体原代培养者明显多于丘脑。皮质与延髓原代培养者，体外培养第7天才见到神经球的产生，且数量明显少于纹状体或丘脑原代培养者。中脑及桥脑原代培养者仅见个别细胞球产生，由于数量过少无法鉴定。皮质、纹状体、丘脑、延髓四种不同脑区来源的神经前体细胞诱导分化后，免疫荧光检测发现MAP2阳性细胞约占总细胞的32％，GFAP阳性细胞约占总细胞的45％，各组之间无明显差异。 结论 12周胚龄左右，人胚胎不同脑区均有神经前体细胞存在。体外分离培养时，神经球的数量及出现的时间，纹状体和丘脑明显多于、早于其他脑区。各脑区来源的神经前体细胞诱导分化后，MAP2及GFAP阳性细胞比例各组之间无明显差异，可能说明神经前体细胞的分化特性比较细胞本身的内在特性而言，更取决于细胞的外在因素。