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高级生物化学Advanced biochemistry 内容 核酸(Nucleic Acid) 核酸参考书 第一章 核酸的结构 第一节 核酸的一级结构 一、概述 二、一级结构序列测定 I型限制性内切酶 II型限制性内切酶 （三）DNA序列测定 DNA序列分析战略 DNA序列分析战略 DNA序列测定方法 双脱氧链终止法 双脱氧链终止法 双脱氧链终止法 Reaction Requirements forDideoxy Sequencing of DNA 化学降解法 化学降解法 质粒测序方法 二、操作过程 MegaBACE instrument 第二节 核酸的高级结构 B-DNA结构要点 第二节 核酸研究方法 （一）琼脂糖凝胶电泳 与电泳迁移有关的因素 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA样品回收方法 PCR技术简史 　 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 PCR技术简史 PCR技术简史 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的步骤 2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)： 　　二、PCR反应参数 二 、材料、设备及试剂 三、操作步骤 三、PCR产物的纯化  PCR的应用 影响深远的生物学技术 1972，基因重组技术 1978，人类试管婴儿技术 1985，DNA扩增技术（PCR） 1990，人类基因组计划（HGP） 1997，哺乳动物克隆技术 一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。 利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。 dNTP应用NaOH 将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4 种 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。 Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。 3. Mg2+： 　4. 模板： PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子,可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA