第二章、第三章外植体的选择和消毒.ppt

第一节 培养基的成分 第二节 培养基的配制 第三节 常用培养基的配方;第一节 培养基的成分;一、准备工作 二、母液的配制与保存 三、培养基的制备 四、培养基的灭菌;准备工作 母液的配制与保存 培养基的制备 培养基的灭菌;一、准备工作;二、母液的配制与保存;2.母液的配制过程（MS）;;;4）铁盐母液;生长素类： 一般，先用少量95%酒精助溶； 2，4—D，O.1mol/L的NaOH或KOH助溶; 单位：0.1-5mg/ml 细胞分裂素类: 一般,先用少量1N盐配溶解,再加温水冷却后定容;附：母液的配制及保存的注意事项;三、培养基的制备;附：计算：制做3L MS+6-BA2mg/l+NAA0.1mg/l +蔗糖3%+琼脂0.6% 需要母液各多少？ 大量元素母液（10倍） ——ml ？ 微量元素母液（100倍） ——ml ？ 铁盐母液 （100倍） ——ml ？ 有机物质母液（100倍） ——ml ？ 6-BA母液 (0.1mg/ml) ——ml ？ NAA母液 ( 0.1mg/ml) ——ml ?? 蔗糖 ——g ？ 琼脂 ——g ？;参考公式：;四、培养基的灭菌;原理： 注意事项：完全排除锅内空气 常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O．05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0．1MPa时压力0．1-0．15MPa，20min。;步骤： ⑴ 放水至平把架； ⑵ 把包扎好的培养基装入高压锅； ⑶ 盖上内锅盖,上紧螺帽，关上气阀和安全阀； ⑷ 然后接通电源、设置温度和时间； ⑸ 排冷空气（自动）； ⑹ 记时（自动） ⑺ 到时，关电源，降压至0，打开放气阀； ⑻ 开盖拿培养基 注意：经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。;第三节 常用培养基的配方及特点;二、培养基的种类及其特点;4)B5培养基 特点：铵盐含量低，硝酸盐含量高，适合于双子叶植物特别是木本植物的生长； 5)KM-8P培养基 1974年,原生质体培养而设计的。 特点:有机成分复杂，包括所有单糖和维生素，适合原生质融合的培养。 ;第三章 外植体的选择与消毒;一、植物基因型 二、外植体部位 三、取材季节 四、外植体的生理状态和发育年龄 五、外植体大小;草本植株木本植物； 双子叶植物单子叶植物； 木本植物中，猕猴桃较易再生植株；而干果 类、松树、柏树等就比较困难； 植物基因型不同，组培再生途径也不同 ;生长健壮无病虫害的植株； 同一植物不同部位之间的再生能力差别较大； 茎尖； 茎段、叶片及其它 ;植物生长的最适时期：生长开始的季节 如苹果芽、百合鳞片; 越嫩，年限越短的组织具有越高的形态发 生能力，如生菜的心叶。;胚胎培养或脱毒，外植体宜小 快速繁殖，外植体宜大 一般外植体：0.5～1.0cm 叶片、花瓣等约为0.5cm2 茎段则长约 0.5-1cm 茎尖分生组织约0.2～0.3mm大小等。;第二节 外植体的消毒方法;一、常用消毒剂及其效果;1、乙醇(70% -75%) 特点：穿透力和杀菌力强，浸润和灭菌； 不能彻底灭菌； 2、升汞(0.1%-0.2%) 特点：灭菌效果好； 容易残留； 3、次氯酸钠(2-10%) 特点：灭菌效果较好，无残留；;4、漂白粉(10% -20%) 特点：低毒有效 易吸潮失效，随配随用； 5、双氧水(6%-12%) 特点：效果较好，易除去； 6、新洁尔灭(1→200) 特点：广谱表面活性灭菌剂，低毒有效；;二、外植体的消毒原则;1、外植体灭菌的一般步骤 预处理 表面浸润：75%酒精 消毒液浸泡 无菌水冲洗;1）茎尖、茎段及叶片等的消毒 2）果实及种子的消毒 3）花药的消毒（整个花蕾或幼穗） 4）根及地下部器官的消毒;1） 茎尖、茎段及叶片等的消毒 自来水冲洗→75%表面浸润后无菌水冲1-2次 →消毒 液采用2%～10%的次氯酸钠溶液浸泡10～25min→无菌水 冲洗3次及以上； 2）果实及种子的消毒 果实：自来水冲洗10～20分钟→酒精迅速漂洗→用2%次氯酸钠溶液浸 10min后→用无菌水冲洗2～3次； 种子：10%次氯酸钠浸泡 20～30min甚至几小时，难以消毒的可用0.l%升汞或1%～2%溴水消毒； 胚或胚乳培养：去掉种皮→4%～10%的次氯酸钠溶液浸泡8