第二章三第四节蛋白质检测.ppt

三 蛋白质电泳技术 电泳——带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis) (一)分类 1、按其支持物的物理性状不同可分为： (1)滤纸及其它纤维电泳：如玻璃纤维膜、乙酸 纤维膜、聚胺纤维薄膜。 (2)凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉 凝胶电泳。 (3)粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 (4)线丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。 2、按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为： (1)平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的 电泳方式。 (2)垂直板式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶可做成垂 直板式电泳。 (3)垂直柱式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳 3、按pH的连续性不同，区带电泳可分为： (1) 连续pH电泳：即整个电泳过程pH保持不变，如 常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。 (2) 非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同 的pH的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳，等电聚焦电泳等 (二）应用： 1、分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等 2、分析某种物质的纯度及分子量 3、电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析 4、免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力 四 氨基酸检测 氨基酸代谢紊乱可从三个水平诊断 定性检测 定量检测 Fischer比与ＢＴＲ值 　　　　　　　　 (三).醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白 架膜 加盖 接导线，开机 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白 电泳仪器 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白 实验操作 浸泡 将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和麻面。 点样 用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。 电泳 将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。 染色 将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重，染色10min。 漂洗 将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无蓝黑色。 返回 * * 第四节 蛋白质与氨基酸检测 内容概要： 二 体液清蛋白测定 一 总蛋白测定 三 蛋白电泳技术 四 氨基酸检测 1、掌握血浆蛋白质的组成、功能及分类；个别血浆蛋白质（前 白蛋白、白蛋白）的来源和生理功能；血清总蛋白和白蛋白的 测定方法和原理。 2、熟悉急性时相反应蛋白的概念和种类；血清球蛋白和纤维蛋 白原的测定方法 3、了解其他蛋白质的来源和生理功能；尿液蛋白和脑脊液蛋白 的检测 。 教学要求： 第二节 体液蛋白质测定 总蛋白测定 个别蛋白质的测定 蛋白分离测定技术 发展趋势: 测定体液标本: 血浆：普遍 尿液，脑脊液和胸腹水等：有选择性的组织病变检查 免疫化学法特异定量个别蛋白质 体液蛋白质的测定方法概括： 常规：免疫浊度法、免疫扩散法，免疫电泳法， 微量：放射免疫测定（RIA），酶免疫测定法（ELA/ELISA） 电泳测定： 定量化学测定TPr，Alb 电泳 组成图谱 半定量 定量 染料结合法，UV法，折光法等 一、血清总蛋白测定 假设： １、 纯多肽链，含氮量平均为16 % ２、各种蛋白质与化学试剂反应性一致，仅为相对定量 测定依据：蛋白质测定一般利用蛋白质以下的结构或性质 1、元素组成测定：含N稳定； 2、重复的肽链结构：具有多个肽键； 3、酪氨酸和色氨酸与Folin-酚试剂反应显色或UV 吸收； 4、与色素结合的能力：与染料以离子键或共价键连接； 5、沉淀后借浊度测定：光度计测定； 6、光折射测定：折射仪测定。 方法： 1.凯氏定氮法－参考方法　　　2.双缩脲法( 推荐) 3.酚试剂法　　　　　　　　　4.散射比浊法 5.染料结合法　　　　　　　　6. UV 法 ７.折光测定法 1.凯氏定氮法－参考标准方法(0.05mg N 0.3g pro) 消化　用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时） 蒸馏　用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发； 吸收　用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使[H+] ） 滴定　用已标定的无机酸滴（使[H+] 恢复），计算总氮量 定蛋白（总氮量-非蛋白氮）×6.25=蛋白含量 纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物，其色度与氨氮含 量