紫外吸收法测定蛋白质含量幻灯片.pptVIP

紫外吸收法测定蛋白质含量 一、实验目的 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理； 熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用方法。 二、实验原理 由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。 三、 实验材料、主要仪器和试剂 1．试验材料：待测的蛋白质溶液。 2．? 主要仪器： （1）紫外分光光度计，（2）试管与试管架，（3）刻度吸量管 3．试剂： （1）标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。 （2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/mL左右的溶液 四、操作步骤 1．标准曲线制作 按下表分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。 以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。 2．样品测定 取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，混匀，按上述方法测定280nm的光密度，并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液的浓度。 五、附注 1．在测定工作中，可以利用280nm及260 nm的光密度值求出蛋白质的浓度： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45OD280nm―0.74OD260nm 上式中的OD280nm是蛋白质溶液在280nm下测得的光密度，OD260nm是蛋白质溶液在260nm下测得的光密度。 2．对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测的蛋白质溶液稀释至光密度在0.2~2.0之间，选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm及260nm处分别测出光密度OD280nm /OD260nm的比值，从下表中查出校正因子“F”值，同时可查出该样品内混杂的核酸的百分含量，将F值代入下述公式，即可计算出该溶液的蛋白质浓度。 蛋白质浓度（mg/mL）= F×OD280nm×D 式中：OD280nm为被测溶液在280nm紫外波长下的光密度，D为溶液的稀释倍数。 OD280nm /OD260nm 校正因子 核酸% OD280nm /OD260nm 校正因子 核酸% 1.75 1.116 0.00 0.846 0.656 5.50 1.63 1.081 0.25 0.822 0.632 6.00 1.52 1.054 0.50 0.804 0.607 6.50 1.40 1.023 0.75 0.784 0.585 7.00 1.36 0.994 1.00 0.767 0.565 7.5 1.30 0.970 1.25 0.753 0.545 8.00 1.25 0.944 1.50 0.730 0.508 9.00 1.16 0.899 2.00 0.705 0.478 10.00 1.09 0.852 2.50 0.671 0.422 12.00 1.03 0.814 3.00 0.644 0.377 14.00 0.979 0.776 3.50 0.615 0.322 17.00 0.939 0.743 4.00 0.595 0.278 20.00 0.874 0.682 5.00 ? ? ? 注：通常纯蛋白质的OD280nm /OD260nm 约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5。 六、思考题 1．紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？ 2．若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？ 参考答案 1．蛋白质测定的Folin-酚比色法（即Lowry法）的定量范围为5～100μg蛋白质，灵敏度高；但操作要费较长时间，且Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用；不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度也稍有不同。 紫外吸收法测蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。 但该法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液中有时混杂有核酸，应予以校正 2．当样品中含有核酸类杂质，可以根据核酸在260nm波长处有最强的紫外光吸收，而蛋白质在280nm处有最大的紫外光吸收的性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差 表1 蛋白质标准曲线