第一章1 紫外可见分光光度法教材课程.pptVIP

第一章 光谱分析; 光是一种电磁辐射,透过介质时将吸收一定波长的光,反射或透过另一部分波长的光. 光谱分析法就是以测定物质发射或吸收的电磁辐射的波长和强度为基础建立起来的分析方法. ;紫外、可见分光光度法 荧光分光光度法 原子吸收分光光度法 红外光谱法;紫外可见分光光度法;运动状态：电子运动、组成分子的各原子间振动、分子的整体转动 对应能级：电子能级、振动能级、转动能级 相应光谱: 电子光谱、振动光谱、转动光谱;特点 ;二、方法原理;生色团：分子中能吸收紫外或可见光的结构单元. 均含π键基团。 助色团：能使生色团吸收峰向长波长位移并增强吸收强度. 并无生色作用，但能增加生色团的生色能力，含有n未成键电子，如-OH，-SH，-X， -NH2 π-π*跃迁：产生强吸收带，摩尔吸收系数达ε达104L/（mol ·cm） n-π*跃迁：吸收光谱强度小，ε一般在500L/（mol ·cm）以下; 如有机化合物含几个生色团,生色团之间由单键分开,不产生共轭效应,则该化合物的吸收光谱基本上由这些生色团的吸收带组成; 如有机化合物含多个相同的生色团,其吸收峰的波长基本不变,而摩尔吸收系数将随生色团数目而增加; 如有机化合物分子中生色团发生共轭作用,则原有吸收峰将发生位移,同时摩尔吸收系数增大.; 溶剂效应：溶剂极性的波动引起某些化合物吸收光谱的红移或蓝移。极性较大的溶剂，一般使π-π*跃迁谱带向长波方向移动，称为红移；极性较小的溶剂，一般使n-π*跃迁谱带向短波方向移动，称为蓝移。 红移效应：吸收峰的λmax向长波方向移动的现象。如某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团之后 (例: 有机苯) 蓝移效应：吸收峰的λmax向短波方向移动的现象。如在生色团一端引入一些取代基后。 ;2. 朗伯-比尔定律Lambert-Beer;三、仪器的结构与原理;1. 辐射光源;2. 分光器;3. 吸收池;4. 检测器;5. 记录器和信号显示系统;四、实验技术;2. 参比溶液的选择 溶剂参比溶液:待测组分溶液的组成较简单,共存组分在测定波长光吸收值很小时,可用溶剂作为参比溶液,可消除溶剂、吸收池等因素影响. 试剂参比溶液: 如显色剂或其他试剂在测定波长有吸收,按显色反应相同的条件,以不加入试样的溶液作为参比溶液.;3. 测定条件的选择 波长的选择: λmax (除:待测组分的λmax受共存杂质干扰或待测组分浓度太高) 狭缝的选择: 不减少吸光度时的最大狭缝宽度 吸光度范围: 0.2~0.8 ;4. 反应条件的选择 溶液酸度: 直接影响待测组分的吸收光谱、显色剂形态、待测组分的化合状态及显色化合物组成. 显色剂浓度: 过量的显色剂可使显色反应趋于完全,但过量太多,有可能改变有色化合物的组成,影响化合物的颜色. 温度的影响: 室温 显色时间: 由于显色反应速率不同,达到反应完全所需的时间;有色化合物维持稳定的时间. ;5. 共存离子的干扰 如共存组分本身有颜色,或能与显色剂反应生成有色化合物,将使测定结果偏高;如共存组分与显色剂反应,使显色剂或被测组分的浓度减少,影响显色反应的完成,会使测定结果偏低. 消除干扰方法： 加入适当的掩蔽剂: 与体系中干扰物质进行配合反应,降低干扰物质的浓度,减少对待测组分的影响. 改变干扰离子的价态: 用氧化剂或还原剂改变干扰离子的价态,使其不影响待测组分的测定. 选择适当的波长: 仅在干扰组分与待测组分的吸收峰波长相距较大的情况下才能使用 预分离: 将干扰组分与待测组分分开;五、紫外、可见吸收光谱的应用范围 ;2. 纯度鉴定 一种纯物质在一定的条件、一定的波长范围内,吸收光谱是一定的.根据它们的吸收光谱最大吸收峰λmax的位置或吸收峰形状和数量,可判断该物质的纯度. 如果是某些生物大分子（如核酸和蛋白质）,可根据它们的紫外光区的特征吸收峰λmax （如核酸在260nm，蛋白质在280nm）处测得的吸收值，通过求出二者吸收值的比值来判断纯度。 纯核酸吸收值的比值A280/A260=0.5 纯蛋白质吸收值的比值A280/A260=1.8;3. 定量测定 （1）比色测定: 大多数采用在可见光波区进行比色分析. 在一定浓度范围内,溶液中溶质的含量与溶液颜色的深浅成正比,而溶液的颜色又与透过该溶液的单色光成反比,与溶液吸收该单色光的强弱成正比. 根据朗伯-比尔定律,待测溶液在一定的浓度范围内吸收值的大小与浓度成正比. 在生物大分子的定量分析中,大部分都是采用比色法.;比色溶液分为: 有色溶液: 蛋白质与某些化学