食品生物技术知识概论.ppt

2.2 基因载体的选择与构建 一、载体的功能、特征及质粒载体 二、噬菌体载体与黏粒载体 一、载体的功能、特征及质粒载体 克隆载体（clony vector）：具有在细胞内进行自我复制的DNA分子，起运送目的基因到受体细胞的作用。 目前基因工程中常用的载体有： 细菌质粒、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体、人工染色体等。 一）载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二）载体应具备的特征条件 1.能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记 多克隆位点(是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段很短的DNA序列。) ori 复制起始点 遗传标记(又称标记基因 ) Amp polylinker 基因载体 三）质 粒 （plasmid） 质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）。 ★不是细菌生长所必需的 ★可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★分子量在1-200kb之间 1、质粒的基本特性 （1）自主复制性 携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制 （2）不相容性 同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容 不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存 （3）可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类 松弛型复制 严谨型复制 （4）可转移性 在天然条件下，大多质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内。 2、质粒载体的构建 　（1） 天然存在的两种质粒 A、colE1宿主细菌大肠杆菌6.5kb松弛型复制20-30/cell B、pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8kb严谨型复制5copy/cell （2） 质粒载体人工构建的目的 天然质粒存在缺陷 不适合用作基因工程的载体 必须对之进行改造构建 方法:重组，“拼拼接接，挖肉补疮” （a）加入合适的选择标记基因 （b）增加或减少合适的酶切位点 （c）缩短长度，增加装载量 （d）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （e）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 2．载体(“交通工具车子”)－基因工程技术诞生的第二个技术准备 （1）?有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个车子（富康） 将重组DNA送到宿主细胞中去。 （2）1946年起，Lederberg就研究细菌性因子（F因子）.50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。 （3）然而，直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。 3．逆转录酶－1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（原因如下） (1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，2.8万个基因，1－3kb/基因，104，2.2*1011公里。 （2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。 （3）经过逆转录mRNA→cDNA (complementory DNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。 有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。  （1）基因 基因是遗传信息的基本单位。 基因是一种物理实体，是一种化学分子，通过改变这个分子的结构可以改变基因的信息内容，从而改变相应的生理功能。 基因通过指导蛋白质或RNA分子的产生，或者通过影响其他基因产生这些产物的方式来发挥其生理功能。 八．基因及基因工程的概念  在染色体或DNA分子上，基因呈线性排列，并非所