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仪器分析课程讲义 第三章 高效液相色谱分析 目录 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法的主要类型及原理 高效液相色谱的分析原理 第一节、高效液相色谱法的特点 一、高效液相色谱法的特点： 1）高效（15 －35mPa）高压泵，高速，高压 2）高效（柱效约为30000n /米）高效固定相 3）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外10-9g，荧光： 10-11g ） 二、 高效液相色谱方法的局限性 1．成本高，且易引起环境污染 2. 缺少通用型检测器 3. 不能替代毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油产品 4. 不能代替中、低压柱色谱法，分析受压易分解、变性的具有生物活性的生化样品。 2．HPLC：分离和分析 柱内径2~6mm，固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱） 柱效高（H↓，n↑） 高压泵输送流动相； 分析时间大大缩短、可以在线检测 HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制。 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，占有机物的80%。 3．操作条件差别 GC：加温操作; HPLC：室温；高压（液体粘度大） 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 1、液-液分配色谱 在液液分配色谱法中，为了避免固定液的流失，采用固定液和流动相的极性相反。 正相 ：流动相的极性小于固定相 反相 ：流动相的极性大于于固定相，正相与反相的出峰顺序相反 2、液-固吸附色谱 3、离子交换色谱 4、离子对色谱 固定相： 阴离子分离：采用烷基铵类. 阳离子分离：采用烷基磺酸类， 应用：分离分析强极性有机酸和有机碱 。适用生化试样核酸、核苷、生物碱以及药物等分离 。 5、离子色谱 6、排阻色谱size- exclusion chromatograph 7、亲和色谱(AC)Affinity chromatograph 液相色谱分离类型参考表 第三节 高效液相色谱分析的原理及分离条件 一、高效液相色谱法的理论基础 1．涡流扩散项 HPLC中该项与GC完全相同。 式中，λ为填充不规则因子；dp为填充物颗粒平均直径。 2．纵向扩散项 由于液相中扩散系数要比气相中小4-5个数量级，HPLC中该项对于谱带扩张的影响可以忽略不计。 3．传质阻力项 HPLC的传质阻力项包括: 固定相传质阻力(Hs)，移动流动相传质阻力(Hm)和滞留流动相传质阻力(Hsm)三项。 (1).固定相传质阻力项 式中，df为固定液涂层厚度；Ds为组分在固定液中的扩散系数；Cs为常数 (2)???流动相的传质阻力项： 式中，dp为填充物平均颗粒直径；Dm为 组分在流动相中的扩散系数；Cm为常数。 (3)滞留流动相的传质阻力项： 式中，Csm是与颗粒微孔和容量因子有关的常数。 该项阻力主要与固定相的结 构有关 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 降低传质阻力是提高柱效主要途径。 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最 直接的因素。 3 .固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。 在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作 .  4.柱外效应(extra column effect) 是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽。 可分为柱前和柱后两种。 柱前展宽：主要由进样引起 柱后展宽：是由接管和检测器流通池体积以及检测器响应时间等因素所引起。 二、影响色谱分离的因素 1. 影响分离的因素与提高柱效的途径 H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同。 2 .流速 流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。 * 三、 HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径1~3cm，固定相粒径100μm 且不均匀 常压输送流动相 ；柱效低（H↑，n↓） 分析周期长、无法在线检测 四、HPLC与GC差别 主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别 1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，仅能分析有机物的20%. 2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用