第六小节蛋白质的分离纯化鉴定.pptVIP

1、离子交换层析 （1）基本原理 利用被分离物质的电荷与层析载体电荷的相互作用达到分离纯化。 层析载体的种类：阳离子交换剂（带负电） 磺酸基（强酸型）SP-Sephadex -O-(CH2)3-SO3H 羧甲基（弱酸型）CM-52 -O-CH2COOH 阴离子交换剂（带正电） 二乙基氨基乙基（中强碱型）DEAE CH2-CH2-N(C2H5)2 季氨盐 （强碱型） N+(CH3)3 基架：交联琼脂糖、交联葡聚糖、纤维素 特点： 1.网状结构，有较大的表面积，大分子可以通过；既能根据净电荷数量又能根据分子大小进行分离。 2.蛋白质混合物的分离可以通过改变溶液中的盐离子强度（低到高）和pH值（小到大）来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。 返回 2 凝胶过滤 原理: 根据蛋白质分子大小不同进行分离。 当蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，随着溶剂在凝胶球间隙中向下移动并最先流出柱外，比孔径小的分子不同程度地进入凝胶珠内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离。 大分子先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱来 3 亲和层析 原理：待分离蛋白质能与另一种称为配基的分子特异非共价结合。 所谓配基是指被大分子蛋白质识别并与之结合的原子、原子团和分子。比如激素和受体、抗原抗体互为配基。 特点：分离蛋白质最有效方法。一般只经一步处理即可使待提纯的蛋白质从复杂的混合物中分离出来。 * 第六节 蛋白质的分离、纯化与测定 一 、目的 1 蛋白质结构、性质和功能研究的要求 2 生产实践的需要 二、蛋白质分离纯化的概念 从复杂的混合物中获得一种具有良好的生物学活性及化学完整性的单一蛋白质。 三、蛋白质纯化的一般原则 1、样品的选择：来源方便、成本低、易操作的组织或细胞。 2、建立一个特异、快速、精确、可重复的检测方法。 3、分级分离，先粗后细、先易后难。 利用简单、易处理并快速的方法粗分，例如硫酸铵沉淀、分级离心等除去大部分杂蛋白。利用离子交换层析、分子筛层析、电泳等进一步纯化。 4、避免蛋白质的变性。（pH中性、适当温度和接近生理状态的缓冲体系等） 四、蛋白质分离纯化的程序（步骤） 前处理（细胞破碎） 抽提 粗分级 纯化 鉴定 分子的大小与形状： 透析、凝胶过滤、超滤、离心 溶解度： 等电点沉淀法、盐析、有机溶剂抽提、 分配层析法 电荷： 电泳、离子交换层析 生物功能专一性： 亲和层析 疏水性： 疏水作用层析 五、蛋白质分离纯化的依据 六、具体方法 (一）、生物材料的前处理 分离纯化蛋白质，首先将蛋白质从原来的组织细胞中以溶解状态释放出来，并保持原来的天然状态和生物活性： １机械破碎法： 利用机械剪切作用，将细胞研碎。 如玻璃匀浆器、组织捣碎机、研钵等。 ２渗透破碎法： 利用低渗使细胞溶胀破碎。例如将红细胞放入水中便发生自溶。 ３交替冻融： 将生物组织冻结后，细胞内容物使细胞涨破。 ４超声波法： 超声振荡，使细胞膜上受张力不均匀而解体。 ５酶消化： 利用蛋白酶、溶菌酶、纤维素酶等对细胞壁和膜的分解作用使他们解体。 (二）、抽提 利用蛋白质溶解性，将目的蛋白溶解到适当的溶剂中。 1 根据分子大小不同的分离法： 1)透析和超过滤： 利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 常用的半透膜是玻璃纸和火棉和其它合成材料。 透析：将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋中放在蒸馏水中进行。 透析外液可以更换，直到透析袋里无机盐等小分子物质降低到最小值为止。 超过滤：利用压力和离心力，强行使其它小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上。 透析：古老方法、时间长、简便 超过滤：高级，较重要 2) 离心 蛋白质分子颗粒的沉降速度取决于其分子大小 例1：差速离心。 交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离。适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。 方法较简单，但分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取 。  例2：密度梯度离心 蛋白质分子颗粒的沉降不仅取决于它的大小，而且决定于它的密度。 如果蛋白质在具有密度梯度的介质中离心，质量密度大的颗粒比质