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第3章 抗体制备 (Preparation of Antibody) ;本章主要内容: 1. 免疫原的制备（Preparation of Immunogen) 2.免疫血清的制备(Preparation of Immune Serum) 3.单克隆抗体制备(Preparation of Monoclonal Ab) 4.基因工程抗体技术(Gene Engineering Antibody); 为什么要制备抗体? ;▲第二代抗体: 单克隆抗体;？;主要内容： 1. 免疫原的制备 2. 免疫血清的制备 3. 单克隆抗体的制备 4. 基因工程抗体技术;一、颗粒性免疫原的制备;（一）绵羊红细胞的制备 ; 绵羊红细胞的制备流程图;（二）细菌免疫原的制备 ▲菌体抗原：需要100℃水浴2～2.5h杀菌，并破坏鞭毛抗原后应用； ▲鞭毛抗原：要用有动力的菌株，菌液用0.3%～0.5%甲醛处理。; 细菌细胞抗原的制备流程图;二、可溶性免疫原制备 试举例哪些为可溶性免疫原？;可溶性抗原的粗提 1．组织匀浆的制备　 　 2．细胞的破碎;破碎方法： 1.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4.表面活性剂处理; （1）酶处理法 常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 方法：在一定的条件下，能消化细菌和 组织细胞;(2)超声破碎法 原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。 由于超声波发生的空化作用,使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。;; 4.表面活性剂处理;（二）可溶性免疫原的提纯 1．超速离心法 2．选择性沉淀法 利用各种蛋白质分子理化特性的差异，采用不同的沉淀剂或改变某些条件、促使某一蛋白质成分沉淀。 ;常用选择性沉淀法: 1）盐析法 最常用的盐溶液是33%～50%饱和度的硫酸铵。简便易行，但纯度不高，只适用于初步纯化。;2）聚合物沉淀法 PEG等可选择沉淀不同分子量的蛋白质。蛋白质分子量越大，沉淀时所需PEG浓度越低。 如，浓度为3％～4％的PEG可沉淀CIC， 6％～7％ 可沉淀IgM， 12％～15％ 可沉淀其它球蛋白， 25% 可沉淀白蛋白。;3）有机溶剂沉淀 降低溶液的介电常数;减弱蛋白质的水化层，破坏蛋白质分子的稳定性，蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。 常用的乙醇与丙酮。;4．离子交换层析 各种蛋白质所带的电荷量不同，与纤维素或凝胶结合能力有差别。 当洗脱时，逐渐增加流动相的离子强度，使溶液中的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位点，不同等电点的蛋白质就可分别解离。;5．亲和层析 亲和层析是利用生物大分子与其配体之间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。 只要将对应体系中的一方偶联于不溶性支持物上，就可从混合物中专一地分离和提纯相应的另一方。;正常细胞 ＋;1．分离非共价键：改变pH；用变性剂 2．分离共价键：解离二硫键，获轻链和重链。 3. 断裂肽键 溴化氰裂解法 酶裂解法;;酶水解免疫球蛋白示意图;（四）纯化免疫原的鉴定 主要包括： 含量、分子量、纯度及免疫活性等鉴定。; 纯化抗原的鉴定;三、人工抗原的制备;1. 载体的选择 常用的载体有： 1．蛋白质类 蛋白质作为一种常用的良好载体,以白蛋白最常用。 2．多肽聚合物 多肽聚合物是由人工合成的，也是良好的载体。常用的为多聚赖氨酸。 3．大分子聚合物 羧甲基纤维素、PVP等均可与半抗原结合。;2. 半抗原与载体的连接 1.物理吸附 载体有PVP和羧甲基纤维素等，它们通过电荷和 微孔来吸附半抗原。 2.化学方法 利用某些功能基团把半抗原连接到载体上，载体包括蛋白质类和人工合成的多聚赖氨酸。 连接方式主要有3种。 ;碳化二亚胺法(羧基-氨基 肽键）;混合;琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备;3. 人工结合抗原的鉴定 至少20个以上的半抗原分子连接到一个载体分子上，才能有效地产生抗体。 方法: 吸收光谱分析法 同位素标记法;(二)人工合成抗原;(三)基因重组抗原;四、佐 剂