心肌细胞膜表面钙离子通道在心房颤动时的表达水平及功能变化-心脏外科学专业论文.docx

博士学位论文中文摘要心肌细胞膜表面钙离子通道在心房颤动时的表达水平及功 能变化中文摘要引言心房颤动(Atrial Fibrillation，AF)是临床上最为常见的心律失常，其主要 表现为400次／分钟的不规则电节律所引起的心房各部分快速颤动，它对人类健 康的影响不容小觑。不论导致何种并发症，AF均可显著增加患者的致残率和死 亡率。它常伴有左心室收缩功能减退和充血性心力衰竭，还可以引起脑血管栓塞。 AF可以恶化患者的生活质量，并消耗大量的医疗资源。但由于目前对于AF的 发生机制尚不十分清楚，因此目前临床上对AF的治疗尚缺乏有效手段。钙离子通道蛋白是一类由多种不同亚型构成的离子通道家族，广泛存在于各 种组织中，其作用涉及生长发育的调控、自律性的调节等多方面。在心肌细胞表 面，目前已证实存在的钙离子通道仅有T型及L型，参与了钙稳态的调控。研 究发现，无论是临床AF患者还是快速心房起搏(Rapid Atrial Pacing)诱发心房 颤动的动物的心房肌细胞中，胞浆内游离钙的水平均明显升高，提示心肌细胞胞 浆内钙超负荷(Intracellular Calcium Overloading)可能与AF的发生密切相关。．心肌细胞胞浆内的游离Ca2+水平(【ca2+】i)取决于两个因素：一方面是出胞的ca2+减少，如SERCA／PMCA系统及Na+．Ca2+／旷．Na+交换系统异常时，均可导 致肌质网及细胞膜回摄及外排Ca2+减少，从而导致细胞内游离钙水平增高；另一 方面是入胞Ca2+增加，入胞的ca2+有两个来源，一是肌质网表面的钙离子通道 (兰利碱受体，1，4，5．三磷酸肌醇受体)释放ca2+增加，二是细胞膜表面的钙离 子通道(心肌表面为T型及L型钙离子通道)介导的细胞外Ca2+入胞增加。由于心房肌细胞膜表面的钙离子通道(T型及L型钙离子通道)是心房肌细 胞胞浆内游离Ca2+的重要来源之一，因此，研究其在AF时表达和功能的改变对 于揭示AF时细胞内钙超负荷形成的机制及作用有着重要的意义。本研究目的是采用多种技术手段研究AF时心房肌细胞膜表面钙离子通道的 表达及功能变化，以此阐述细胞膜钙离子通道在AF时心房肌细胞胞浆内钙超负 荷形成中的作用。标本是采自于接受开胸心脏手术患者的少量心房肌组织，按照 基础疾病类型和心律分组，借助于分子生物学及免疫组织化学方法比较了风湿性 AF组患者、风湿性窦性心律患者和正常窦性心律患者之间T型和L型钙离子通 道的表达水平，并用激光共聚焦显微镜钙成像技术比较了两种钙离子通道不同心 律组患者中对ca2+通量的影响。2博士学位论文 中文摘要第一部分心肌细胞膜表面钙离子通道(T型及L型)在心房颤动及对 照组心房肌组织中的表达差异目的： 研究正常窦律(NSR)、风湿性瓣膜病窦律(RSR)及风湿性瓣膜病房 颤(鼬虾)三组患者右房组织中L型钙离子通道alC和T型钙离子通道alG、alH 亚基mRNA丰度及蛋白定位和表达差异。方法： 术中获取各组患者(NSIbl0，RSR=Il，RAF=16)少量右房标本，所 有纳入患者在建立体外循环后、灌注心肌停搏液前切取少量心房肌组织(约200mg～400mg)，于冰生理盐水中洗净血迹，分为两部分，一部分(大小约200rag) 剪切为小块组织后放入无RNA酶的冻存管中，迅速置入液氮中冷冻，随后转入．80℃深低温冰箱保存；剩下组织放入10％中性福尔马林溶液中固定，留作免疫 组化染色用。提取总RNA，设计引物，实时荧光定量RT-PCR对各组alC、alG及alH亚基的mRNA丰度相对定量(2心‘法)；提取总蛋白，蛋白免疫印迹法比较三种仅1亚基蛋白表达水平；HE染色及免疫组织化学染色比较三组标本的差 异。结果： 与NSR及RSR组相比，RAF组的alC及alH的mRNA丰度及蛋白水 平显著上调(火0．05)，alG表达水平三组间差异不显著；三种a1亚基在NSR 及RSR两组间表达水平无显著差异；HE染色及免疫组化染色发现RAF组较另外两组间质增生明显，核粗大，细胞膜表面通道蛋白重染，RSR组及NSR组则差异不明显。结论：房颤时，alC及alH亚基表达水平上调，而alG亚基表达水平不变； 风湿性因素对L及T型钙离子通道的表达并无直接影响，但不能排除其对钙离 子通道功能发生影响的可能。 关键词：风湿性心脏病；心房颤动；钙离子通道：心肌细胞3博士学位论文中文摘要第二部分心肌细胞膜表面钙离子通道(T型及L型)在心房颤动组及 对照组中的功能差异目的：1、在分离人单个心房肌细胞的经典方法基础上，探索适合本中心所获 得的心房颤动患者心房肌组织的心肌细胞分离方法； 2、在分离获得的单个心房肌细胞基础上，借助于激光共聚焦荧光倒置显微镜及 钙成像技术，观察心房颤动组及窦率组不同钙离子通道激活前后胞浆内游离Ca¨