人t细胞免疫球蛋白黏蛋白与凋亡细胞的相互作用研究-临床检验诊断学专业论文.docx

第三部分人T细胞免疫球蛋白黏蛋白与凋亡细胞的相互作用研究目的：为了研究人T细胞免疫球蛋白粘蛋白基因家族与凋亡细胞之间的相互作用，以进一步探讨TIM基因家族在细胞凋亡中作用。方法：我们构建含人TIM基因三个成员不同长度片段的9种pEGFP-N1真核表达载体及其Ig融合蛋白表达载体。将这些构建的真核表达载体瞬时转染CHO细胞，并收集上清液。直接采用TIM-EGFP融合蛋白与PI为探针，检测TIM蛋白与凋亡细胞的相互作用。结果：人TIM基因家族的3个蛋白都能直接识别和结合凋亡细胞，而与活细胞不能结合。并且，sTIM-1-EGFP、sTIM-3-EGFP和sTIM-4-EGFP融合蛋白与凋亡细胞之间的相互作用被相应的TIM-1-Ig、TIM-3-Ig和TIM-4-Ig所阻止。而且，结果表明人TIM 基因家族的3个蛋白通过其IgV区直接识别和结合凋亡细胞。结论：人TIM基因家族的3个蛋白充当凋亡细胞的受体，可能在细胞凋亡调控中起重要作用。人TIM蛋白可以作为新的蛋白用于细胞凋亡的检测。关键词：T细胞免疫球蛋白粘蛋白；融合蛋白；受体；免疫应答；细胞凋亡；过钒酸钠第四部分人TIM-EGFP融合蛋白的在大肠杆菌中的表达和特征的研究目的：为了探讨人TIM-EGFP融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化，并评价它们的生物活性。方法：采用PCR分别扩增人TIM基因家族3成员和EGFP片段，并且将它们克隆至原核表达载体pET-28a中。构建的重组质粒pET-28a-TIM-EGFP分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达TIM-EGFP融合蛋白。表达的融合蛋白经Ni-NTA树脂纯化，并且通过荧光显微镜检测它们与凋亡细胞的结合活性。结果：我们分别成功构建人TIM-1-EGFP、TIM-3-EGFP和TIM-4-EGFP的融合蛋白表达载体，并在大肠杆菌中表达。我们结果证明TIM-EGFP融合蛋白3个成员都能直接识别和结合凋亡细胞，而与活细胞不能。我们更进一步证实TIM-4-EGFP与凋亡细胞的相互作用可以被相应的TIM-Ig融合蛋白阻止。结论：我们分别成功构建人TIM-1-EGFP、TIM-3-EGFP和TIM-4-EGFP的融合蛋白表达载体，并在大肠杆菌中表达。据我们所知，这是目前首次在大肠杆菌中表达TIM 基因家族的3个成员。我们结果也表明人TIM基因家族介导与凋亡细胞的识别和结合。而且，纯化的融合蛋白可以作为准备好的生物活性的TIM-1、TIM-3和TIM-4 来源，这为进一步研究人TIM-1、TIM-3和TIM-4基因和它们的相应受体功能和调节机制奠定基础。关键词：T细胞免疫球蛋白粘蛋白-1；T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3；T细胞免疫球蛋白粘蛋白-4；基因表达；大肠杆菌AbstactPartIEstablishmentofareal-timeSYBRGreenIquantitativeRT-PCRassayfordetectionofhumanTIM-1andTIM-3mRNAObjective:ThisstudyaimedtodevelopaSYBRGreenIreal-timequantitativeRT-PCRassay（FQ-PCR）fordetectionofhumanTIM-1andTIM-3mRNA.Methods：TotalRNAextractedfromperipheralbloodmononuclearcell（PBMC）of humanwasreversetranscribedtocDNA.TheprospectiveampliconsofhumanTIM-1andTIM-3wereamplifiedandpurified,thenwereligatedwithpMD18-TSimplevectorandtransformedintobacteriumDH5α,respectively.PlasmidDNAextractedfrompositivecloneswereverifiedbyPCRamplificationandsequenced.TheconcentrationofpurifiedDNAtemplatewasdetectedbyanalyzingabsorbancein260nmandthenthecombinedplasmidwasdilutedtoseriesasstandardforFQ-PCR.TIM-1andTIM-3wereamplifiedby real-timefluorescencequantitativePCRfromtheplasmidDNA,respectively.Results：ThemethodsofTIM-1andTIM-3mRNAreal-timePCRwerewelles