胡忠义讲义幻灯片.pptVIP

 噬菌体空斑技术在结核杆菌 检测及耐药性测定中的应用 胡忠义 上海市肺科医院结核基础实验室　　　 全球结核病疫情概况 世界卫生组织估算: 全球有近20亿人口受结核菌感染， 现有结核病人约2000万， 每年新发结核病人800-1000万人, 全球每天有8000余人死于结核病， 每年死亡300万人，达历史最高 水平，成为传染病的头号杀手。 如果不立即采取控制措施，预计在10年内: 将有9000万病例发生， 3000万病例死亡， 3亿健康人受结核菌感染。 1993年WHO发布了“全球结核病紧急状态宣言” 1998年又再度明确指出：“发动阻止结核病的 运动已刻不容缓 1．感染率高：全国至少有5亿以上人口受到结核菌感染。 2．患病率高：全国约有结核病人600余万，其中200余 万为涂阳肺结核病人。 3. 发病率高： 每年至少有113万新的结核病病例发生, 4. 死亡率高：结核病死亡率为21/10万，每年因结核病 死亡人数达25万，是单一病菌引起死亡 最多的传染病。  我国结核病疫情 据第三次全国结核病流调揭示： 5. 耐药率高：初始耐药率28.1％，继发耐药率为41.1％， 6．递降率低：活动性肺结核年均递降率仅为 2.8 ％，由 于递降速度慢，人口增长速度快，故总病 例数略有上升。 7．青壮年患病和死亡比例高：青壮年活动性和涂阳肺结 核病人分别占总病人数的57.9％和69.3％， 青壮年结核病死亡占结核病总死亡的48％， 严重影响劳动力。据估算，每年因结核病约 丧失1.4亿个劳动日，国民生产损失达35亿元。 新世纪结核病控制的难题 1. 人口流动 2．HIV感染 3. 耐药株的流行 结核病实验室诊断现状 涂片镜检 培养 X线诊断 分子生物学诊断 一、噬菌体空斑技术检测结核杆菌 自1947年第一个分支杆菌噬菌体被分离到现在，已发现250多种分支杆菌噬菌体。近年来分支杆菌噬菌体在结核病实验室研究中取得了很大进展，其中最引人注目的是噬菌体快速空斑技术检查ＴＢ菌及其耐药性测定。现将方法介绍如下。 噬菌体？ －病毒 溶菌性噬菌体 1. 原理 分支杆菌噬菌体只能感染相应的活的分支杆菌，如待检标本中含有相应的活的分支杆菌，则噬菌体侵入菌体内，并在菌体内大量增殖，最终裂解菌体，释放出来的噬菌体 即可感染随后加入的指示细胞，并使指示细胞裂解，在培养皿上出现噬菌斑。如待检标本中无相应的分支杆菌，则噬菌体被随后加入的杀毒剂杀死，故随后加入的指示细胞因未受噬菌体感染， 因此培养皿中无噬菌斑出现。 2. 操作流程图： 3. 具体方法 1 ）标本前处理－同常规罗氏培养法: 视痰标本性状，加l～2倍体积4％氢氧化钠(Na0H)消化液于痰瓶中，涡旋振荡器振荡2～3分钟，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化 钠消化液后起，整个处理时间不得超过20分钟。样本数较多时，应分批处理。 3. 具体方法 2） 噬菌体侵染： 取0.5ml处理后的样品（或菌液），加 0.1 ml分支杆菌噬菌体，震荡混匀，36OC孵育1小时。  3. 具体方法 4)浇注培养皿： 在上述培养液中加入1ml指示细胞，混匀后与5ml溶化的琼脂共同倾注于无菌平皿中，静置成型后36OC培养18-24小时。每次检测同时设空白对照、噬菌体对照、杀毒剂对照和指示细胞对照。 3. 具体方法 5) 结果观察： 在各对照组结果正确的条件下，观察试验样品结果。阳性结果可见有数量不等的噬菌斑出现，或许多噬菌斑相互融合成透明状；阴性结果可见指示细胞在琼脂培养基中