4.2 血红蛋白的提取和分离—《K三关》2017-2018学年高二生物人教选修1.doc

专题4 DNA和蛋白质技术 课题2 血红蛋白的提取和分离 一、凝胶色谱法 1．概念：凝胶色谱法也称作 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。 2．原理：大多数凝胶是由 构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时， 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 。 二、缓冲溶液 1．作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制 对溶液 的影响，维持pH基本不变。生物体内进行的各种生物化学反应都是在 进行的，为了能够在 下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外溶液的 与体内环境中的pH基本一致。 2．配制：通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。 三、电泳 1．概念：带电粒子在 的作用下发生 的过程。 2．原理：许多重要的生物大分子，如 、 等都具有 的基团，在一定的pH下，这些基团会带 或 。在电场的作用下，这些带电分子会向着 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。 四、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。 1．样品处理 血红蛋白由4条肽链组成，包括两条 和两条 。每条肽链环绕一个 基团。血红蛋白因含有血红素而呈现 。 样品处理包括 、 、 、 等几个步骤。 2．透析 去除样品中相对分子质量较小的杂质。 3．凝胶色谱操作 凝胶色谱操作包括凝胶色谱柱的制作、 、 等。 4．SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断 的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。 一、 1．分配色谱法 相对分子质量的大小 2．多糖类化合物 相对分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 二、 1．外界的酸和碱 pH 一定的pH下 实验室条件 pH 2．1~2 使用比例 三、 1．电场 迁移 2．多肽 核酸 可解离 正电 负电 与其所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 四、样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 1．α-肽链 β-肽链 亚铁血红素 红色 红细胞的洗涤 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液 透析 3．凝胶色谱柱的装填 样品的加入和洗脱 4．纯化 一、蛋白质的分离原理与方法 1．分离原理 依据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质、对其他分子的亲和力等，来分离不同种类的蛋白质。 2．凝胶色谱法 （1）概念：凝胶色谱法也称为分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，利用具有网状结构的凝胶的分子筛，来进行分离。 （2）凝胶：一些微小的多孔球体（内部有许多贯穿的通道，由多糖类构成，如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）。 （3）原理 分离物质 直径大小 运动方式 运动速度 运动路程 洗脱次序 相对分子质量较大的蛋白质 较大 不进入凝胶内部的通道，在凝胶外部向下移动 较快 较短 先流出 相对分子质量较小的蛋白质 较小 进入凝胶内部的通道，无规则的扩散运动 较慢 较长 后流出 3．缓冲溶液 （1）概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变的溶液叫做缓冲溶液。 （2）配制：缓冲溶液通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。例如，人体血液中存在的缓冲对有NaH2P