第四章_第四节电泳技术.pptVIP

第四章第四节 电泳技术（P95） 一、概述 二、电泳的基本原理 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 四、SDS五、等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳 六、聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2-DE） 七、毛细管电泳 一、概述 电泳（electrophoresis，EP）：在外界电场的作用下，带电的物质向其所带电荷的相反电极方向移动。（P41） 电泳的类型（P42） 二、电泳的基本原理 蛋白质的电荷取决于蛋白质分子的性质及溶液的pH和离子强度。 电泳迁移率：指带电颗粒在单位时间和单位电场强度下，在电泳介质中的泳动距离。（U＝d / tE） 影响电泳迁移率的因素 1. 带电颗粒所带净电荷大小、颗粒大小和形状 2. 外界主要因素 （1）电场强度 （2）溶液的pH（电极缓冲液） （3）溶液的离子强度 （4）电渗现象（电场中的液体对于固体支持物的相对移动） （5）支持介质 （6）温度（控制电压或电流；冷却散热装置） 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）丙烯酰胺凝胶聚合原理及有关性质 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE）是由单体丙烯酰胺（Acrylamide，Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylamide，Bis），在加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（Tetramethylethylenediamine，TEMED）和催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate，AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。 AP在水溶液中形成一个过硫酸自由基，此自由基再激活TEMED。随后，TEMED作为一个电子载体提供一个未配对电子，将丙烯酰胺单体转化成一个自由基，从而使其自身被激活。被激活的单体和未被激活的单体反应，开始了多聚链的延伸。正在延伸的多聚链也可以随机地通过Bis的作用进行交叉互联，成为网状结构，最终集合成凝胶状。（P43） 凝胶的机械性能、弹性、透明度、黏稠度和聚合程度与凝胶总浓度及交联度有关。 凝胶总浓度T＝（a+b）/m 交联度c＝b/（a+b） a＝Acr克数，b＝Bis克数， m＝缓冲液体积（mL）。 a/b=30左右时，凝胶透明又有弹性。 凝胶的孔径可以在一较宽范围内变化以适合不同的分离需要。 （二）PAGE的原理 （二） PAGE的原理 电荷效应 各种蛋白质因所带的电荷多少不同，在电场中有不同的迁移率。 表面电荷越多，迁移越快；表面电荷越少，迁移越慢。 分子筛效应 由于一定浓度的聚丙烯酰胺具有一定大小的孔径，分子大小及形状不同的蛋白质在其中泳动时，因受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。 分子质量小且呈球形的蛋白质分子所受阻力小，迁移快；分子质量大，形状不规则的蛋白质分子所受阻力大，迁移慢。 浓缩效应 不连续电泳体系才具有浓缩效应。 凝胶浓度的不连续性。 浓缩胶/堆积胶，浓度较小（常用4％左右），孔径相对较大，样品在其中泳动较快，被浓缩成一个狭窄的区带。 分离胶/电泳胶，浓度较大，依据所分离的样品情况而定，样品在其中泳动较慢，使其在分离胶中能得到高分辨率的分离。分离胶可以为均一胶，也可以为梯度胶。 离子成分及pH的不连续性。 浓缩胶和分离胶的缓冲液均为Tris-HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子。HCl易解离出Cl-，在电场中迁移快，走在最前面，称为先导离子或快离子。 电极缓冲液为Tris-glycine，glycine在pH6.8左右的浓缩胶时，解离度小，在电场中迁移慢，称为尾随离子或慢离子。 大多数蛋白质分子的迁移率介于快、慢离子之间，在快、慢离子形成的界面处被浓缩成极窄的区带。 当glycine进入pH8.8左右的分离胶时，解离度增大，迁移率超过蛋白质，因而，Cl-和甘氨酸根离子沿着离子界面继续前进，蛋白质被留在后面，不受离子界面的影响而逐渐分离。 电位梯度的不连续性。 电泳速度＝电位梯度 × 迁移率。 快离子进入浓缩胶后，很快就超过蛋白质，因而在快离子后形成一个低离子浓度区，此区的电位梯度却高，使得快离子后面的蛋白质和慢离子加速移动。蛋白质的迁移率介于快慢离子之间，于是样品蛋白在高、低电位梯度间移动界面附近得以浓缩。 （三）聚丙烯酰胺凝胶电泳所需的设备 圆盘电泳 板状电泳 优点： 1. 容易散热。使热效应引起的蛋白区带变形减少。 2. 包括标准分子量蛋白质在内的多个样品可以在相同的条件下电泳，便于直接比较各样品产生的区带图。 3. 便于干燥储存、放射性自显影或转移后做免疫印迹。 4. 胶的矩形截面使光密度测定和照相时产生光学假像的可能性减少。 5. 制备方便；易剥离；样品用量少；分辨率高；既可用于分析，也可