干细胞杂谈 (2).pptVIP

* 深圳干细胞库内部交流会议 细胞培养原理及讨论 深圳干细胞库：李智龙 说在前面的话——生命的印象 神圣 神秘 神奇 框 架 Scheme 细胞培养的历程 细胞体外培养的生长特性 培养中的注意事项 自己的想法 致谢 细 胞 培 养 的 历 程 1885年，Wilhelm Roux把鸡胚髓板在温热的盐水中维持其存活若干天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 培养基条件不理想 难以重复 细 胞 培 养 的 历 程 直到1907年，美国胚胎学家Ross Harrison的实验才被公认为组织培养真正开始的标志，而且证明了生物组织的功能可以在体外十分明确地延续下去。 Ross Harrison将蛙胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且居然还从细胞中长出了轴突(神经纤维)， 解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的可能性 悬滴培养法 1912年，当时的Carrel是外科医生，在实验中特别注意无菌操作。他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，并且设计了用卡氏瓶培养法。1923年，Carrel用这种方法，曾培养一鸡胚心肌组织长达数年之久。 1951年，厄尔利开发了动物细胞体外培养的培养基，动物细胞培养技术开始形成。 1952年，盖伊等建立了Hela细胞系（人子宫颈癌细胞系） 30年代，滚瓶开始使用；60年代，生物反应器/微载体开始使用。 细 胞 培 养 的 历 程 1 悬浮生长 2 贴壁生长 细 胞 体 外 培 养 的 生 长 特 性 常见于血液细胞、某些肿瘤细胞，细胞类型较少。 如：jurkat、K562 必须贴附于支持物表面才能生长，是大多数有机体细胞在体内生长发育的基本方式，基于这种特性才使得细胞与细胞之间相互结合形成组织，细胞与周围环境也能够保持联系。 一，动物细胞体外生长方式： 成纤维细胞性：梭型或不规则三角，细胞群连接成网，生长时呈放射漩涡走向； 上皮细胞型：扁平不规则多角形，呈铺路石状生长 游走细胞型：游走，位置不固定，不连接成片 多形细胞型：形态不规则，细长型胞突；神经细胞 细 胞 体 外 培 养 的 生 长 特 性 二，贴附方式： 细 胞 体 外 培 养 的 生 长 特 性 游离期：悬浮，胞质回缩、胞体呈圆球 贴壁期：附着于底物，10min-4h，极性 潜伏期：有生长，无分裂，6-24h 对数生长期：成倍增长，活力强 生长停滞期：空间、营养限制，分裂停止 三，每代贴附生长细胞的生长过程： 细 胞 体 外 培 养 的 生 长 特 性 贴壁全过程： 无污染 细菌 真菌 支原体 病毒 生长环境： PH 温度 光线 营养： 基本营养 细胞因子 细 胞 体 外 培 养 的 生 长 特 性 四，细胞的生长条件 尽可能的模拟体内条件 细 胞 体 外 培 养 的 生 长 特 性 4.1，生长环境 温度：与多数哺乳动物体内温度相似，37℃±0.5℃，实践证明，细胞对低温的耐受性要比对高温的耐受性强些。在培养箱中，要留有足够的空间以利于空气循环，拒绝“冷点”。 PH值：细胞培养的PH最适为7.2一7.4间，当PH低于6.0 或高于7.6时，细胞的生长会受到影响。但是，多数类型的细胞对偏酸性的耐受性较强。 细 胞 体 外 培 养 的 生 长 特 性 4.1，生长环境 气体：代谢产物的CO2在培养环境中能与培养液中的NaHCO2形成缓冲体系，调节PH的作用。 培养基的深度会影响氧气在细胞中的扩散率，应控制在0.2~0.5ml/cm2之间，此外低氧培养有利于干细胞未分化状态的保持。 光线：是一种诱导分化信号，也可使培养基中部分成分分解 细 胞 体 外 培 养 的 生 长 特 性 4.2，营养成分 基本营养成分： 在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢及核酸代谢所需要的各种组成，如包括十几种必需氨基酸及其它多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。 血清：含有生长因子可促进细胞增殖，含有附着因子促进细胞贴壁，同时也是矿物质、脂类、激素的来源。 血清的缺点：成分不明、作用不定、难以质控、污染风险、生长抑制 细 胞 体 外 培 养 的 生 长 特 性 4.2，营养成分 添加成分： L－谷氨酰胺：脱掉氨基后，可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。降解会导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性