dna模板点击化学在生物传感器中的分析与应用word格式论文.docx

湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权湖南大学可以将本 学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□，在______年解密后适用本授权书。2、不保密囚。（请在以上相应方框内打“√”）作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日摘要Cu + 催化的炔化物和叠氮化物的偶极环加成反应是“点击化学”的典型例 子，该反应具有反应条件温和、产率高、副产物少等优点，已经大量用于生物 大分子的标记。此外， 这种点击化学反应对 Cu + 离子催化有很高的特异性，已 经用于开发铜离子的生物传感方法 。但传统的有机点击反应 ，需要较高的反应 物浓度以及长时间的反应，并且检测限相对偏高。 DNA 模板有机合 成（ DTS）是一种极具创新性的技术 。它能显著地增加反 应分子的有效摩尔浓度 。同时 ，通过 DNA 杂交 ，拉近了修饰在 DNA 上的小分 子反应基团之间的距离 ，该方法能明显的加快反应速率 。通过 DNA 将 DNA 相 关技术引入到非天然合成反应中，有助于反应基团的识别、合成步骤的设计、 反应选择性的提高以及反应的放大 。基于上述优点 ，DTS 在许多方面都有着广 泛的应用前景 ，它是小分子库构建 、生物活性分子筛选和多肽均相合成等的有 效方法 。然而 ，DTS 在生物分析领域的应用仍处于起始阶段 。虽然前人在这方 面研究甚少，但 DTS 的内在优势和强大功能奠定了其在生物传感中应用的基 础。 基于以上考虑，并综合相关文献报道，本论文将点击反应与 DTS反应相结 合 ，利用 DNA模板点击化学反应 ，开发了一系列新型的化学生物传感方法 。此 外 ，考虑到点击化学在生物大分子标记上的卓越贡献 ，本论文将点击化学引入 到生物大分子自由基的检测上来 ，希望能开发一些更为简便的检测生物大分子 自由基的方法。 （ 1）构建了一种基于 DNA模板点击化学反应的新型 Cu 2+ 的荧光检测平台。 本方法利用 DNA模板点击化学反应的高特异性用于目标分子识别 ，DNA链取代 和磁珠分离作为信号的传导，高灵敏性的 SYBR Green I染料作为信号输出。与 传统的点击反应方法相比较，该方法 具有更高的灵敏度和更低的检测限（ 290 nM） 等优点。 此外， 只需要把 DNA上的叠氮基 -炔基换成其他能形成共价键的 功能基团就可以把该传感系统用于其他物质的检测 。这为各种生物传感器的构 建提供了一个很有潜在应用价值的通用平台。 （ 2）由于在前一个工作中，需要磁珠分 离过程，操作比较繁琐，而且检 测时不是在均相里完成 。因此 ，我们开发了一个更加简便的 Cu 2+ 传感方法 ，可 以实现加入混合就能输出信号。这种方法是基于 DNA模板点击反应生成的 G四 面体（ G4）结构并用于高灵敏检测 Cu 2+ 的新型荧光传感方法。由于结晶紫与 G4 结合后能极大地增强其荧光强度，因而被 选做信号输出分子。鉴于结晶紫 能探测 G4 结构的变化，我们把一段富 G序列的 DNA分开成两段长度不等的短 链 DNA，然后通过 DTS反应使其连接起来并形成分子内 G4 结构，而结晶紫可 以用于识别这一结构的变化。由于 DTS反应的高产率和点击化学的高特异性， 这种传感器也展示了较高的灵敏度和选择性 。此外 ，由于活细胞内含有丰富的 谷胱甘肽（ GSH），本方法可能用于生物体内的 GSH/Cu(I)加合物检测。因此， 以本方法为例，我们证明了通过合理设计后， DTS调控的分子内 G4 结构的形 成在生物传感器的开发上具有良好的应用前景。 （ 3）简便、可视化检测、可以实现现场 化检测是未来分析检测方法的发 展趋势，而比色分析则刚好符合这些 要求。因此，我们提出了一种基于 Cu + 催 化的点击化学反应和未修饰 AuNPs 作为比色指示剂的 Cu 2+ 比色检测的简便方 法 。用于点击反应的 DNA探针由两部分组成 ：一部分是一条修饰了叠氮基团的 单链 DNA（ ssDNA）与一条长链的 ssDNA的部分碱基形成的双链 DNA（ dsDNA）； 另一部分是一条与长链中未杂交的碱基互补的炔基化标记的短链 ssDNA。由 于 短链 ssDNA