hbv通过调节mir499a抑制靶基因cflar表达-hbv inhibits cf lar expression of target gene by regulating mir 499a.docxVIP

英汉缩略语名词对照英文缩写Ad-HBV英文全称Adenovirus expression HBV中文全称表达 HBV 腺病毒Ad-GFPAdenovirus expression GFP表达 GFP 腺病毒ddH2Odouble-distilled water双蒸水DNAdeoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸HBeAgRNAhepatitis B e antigenribonucleic acid乙型肝炎病毒 e 抗原 核糖核酸hhour小时gLAgravityluria-bertani medium+ampicillin重力加速度含氨苄青霉素的 LB 培养基PCRPolymerase chain reaction聚合酶链式反应HCChepatocellular carcinoma肝细胞性肝癌mRNAMmessenger ribonucleic acidmol/l信使核糖核苷酸摩尔每升HBVhepatitis B virus乙型肝炎病毒PLBPBSpassive lysis bufferphosphate buffer solution裂解液磷酸盐类缓冲液SDS-PAGpolyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳rpmrevolutions per minute转速每分cDNArpmcomplementary DNArevolutions per minute互补脱氧核糖核酸转/每分钟mlmilliliter毫升WBwestern blot免疫印迹Vbpvoltagebase pair伏特碱基对1HBV 通过调节 miR-499a 抑制靶基因 CFLAR 表达摘要目的探讨 HBV、miR-499a 及靶基因在肝癌细胞中的关系。 方法1.通过实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测 miR-499a 在 HepG2 与 HepG2.2.15 细胞中、表达 HBV 的腺病毒瞬时感染 HepG2 细 胞（ Ad-HBV-HepG2 ） 与 其 对 照 组 感 染 GFP 的 HepG2 细胞 （Ad-GFP-HepG2）中的表达。2. 构建 miR-499a 的 过 表达质 粒 (pTARGET-miR-499a) 并 且运 用 Real-time PCR 的方法验证过表达效果，通过 miRNA 靶基因预测软件 如 TargetScan 和 miRDB，筛选到 miR-499a 靶基因 CFLAR，构建靶基 因 CFLAR 的 3′UTR（3′端 Untranslated Regions）野生型和突变型荧光 素酶报告质粒，运用荧光素酶报告系统检测靶基因 CFLAR 与 miR-499a 的相互作用。.通过 Real-time PCR 在 mRNA 水平和 Western-blot 在蛋白质水平 验证 CFLAR 是否为 miR-499a 的靶基因。购买 miR-499a 的抑制剂 miR-499a inhibitor，通过 Real-time PCR 的方法验证干扰效果，再运用 Real-time PCR 和 Western-blot 实验进一步验证 CFLAR 是 miR-499a 的 一个靶基因。.通过 qRT-PCR 和 Western Blot 检测 HBV 对 CFLAR 表达的影响。2结果1.miR-499a 在 HepG2.2.15 细胞中的表达高于 HepG2 细胞，在Ad-HBV-HepG2 细胞中的表达高于 Ad-GFP-HepG2 细胞。2. miR-499a 通过结合 CFLAR 的 3’UTR 来抑制其表达。3.在 SMMC7721 细胞中过表达 miR-499a，CFLAR 在 mRNA 和蛋 白水平表达降低。干扰 miR-499a 的表达，CFLAR 在 mRNA 和蛋白水 平表达升高。4.HBV 抑制 CFLAR 的表达。 结论在肝癌细胞中 HBV 能上调 miR-499a 的表达，CFLAR 是 miR-499a 的靶基因之一， HBV 可以通过上调 miR-499 的表达抑制 CFLAR 的表 达。关键词: HBV,miR-499a, CFLAR3HBV INHIB IT EXPRESSION OF CFLAR BY REGULATING MIR-499A IN HEPATOMA CELLSABSTRACTObjectiveTo investigate the association of HBV, miR-499a and CFLAR in hepatoma cells.MethodsTo ascertain whether HBV could influence expression of miR-499a,