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hif1α对ddah1的调节及机制研究-study on the regulation and mechanism of hi f1 α to dda h1
独创性声明本人郑重声明,本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名:日期:年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□,在年解密后适用本授权书。不保密□。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名:指导教师签名:日期:年月日日期:年月日研究背景HIF-1α众所周知是一个多亚基蛋白,能调节转录,调控在缺氧情况下某些基因的转录激活。缺氧时HIF-1α蛋白水平的升高,HIF-1α通过调控一系列基因的表达,来应对机体或细胞对缺氧的应答1,从而保护组织减少缺血的损伤。研究发现,缺氧均能诱导一些基因的合成如血管内皮生长因子(VEGF),内皮一氧化氮合酶(NOS)等能够增加血管壁的通透性,舒张血管增加组织的供氧量,HIF-1α是通过结合到DNA启动子区的缺氧反应元件(HRE)促进上述基因表达的2。HRE(5-RCGTG-3)是HIF-1α的结合位点有着重重要功能,目前研究发现在已知的缺氧调控的基因如血管内皮生长因子A(VEGFA),Pgk1基因和LOX都有HRE元件2。HIF-1α的调节功能是通过调控靶基因的HRE来影响靶基因的转录,从而可以提高局部或全身氧供。因此,HIF-1α是一种在缺氧情况下的转录因子。如图:HIF-1αIschemia/ReperfusioniNOSEPOCOX-2AntioxidantsystenmsGlut-1VEGFRos,Ca2+,ATPDepletionMitochondrialInjuryDNADamageOxidativeInjuryCellDeath一氧化氮(NO)在心血管系统稳态的维持中起着核心作用3-5,除了血管舒张作用外,NO还介导着多种心血管保护作用,如降低内皮细胞黏附分子的表达及白细胞黏附,控制血管平滑肌细胞增殖,抑制血小板聚集和血栓形成,促进血管新生,从而抑制动脉粥样硬化的发生和发展,并在心脏缺血/再灌注损伤中起着重要的作用。因此NO及其相关代谢途径成为心血管疾病防治研究的重要靶点。不对称二甲基精氨酸(ADMA)是一种在血浆中循环的天然氨基酸,且广泛分布于组织和细胞中6-8,引起广泛关注的原因是因为它能够抑制NOS,所以拥有产生生物学效应的可观潜能,尤其是在心血管系统。目前,部分研究表明一定血浆浓度的ADMA深刻影响着内皮细胞的功能9。内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制剂,ADMA是冠心病患者的主要危险因素9-11。ADMA和L-精氨酸是天然存在的一氧化氮合酶抑制剂。DDAH为ADMA的和L-精氨酸在体内降解酶12。如图所示:不过,目前尚不清楚CoCl2能否通过HIF-1α来介导DDAH1的调节?在本研究中,我们探索CoCl2对DDAH1表达影响及HIF-1α对DDAH1调控的机制。研究的结果表明DDAH1是缺氧诱导基因,其转录是通过HIF-1α结合到DDAH1启动子区的-370~-387(大鼠)HRE元件来调控DDAH1的表达。动物实验材料与方法选取200g左右雄性wistar大鼠若干,随机分为2组,每组8只,分别为:CoCl2组腹腔注射CoCl2(30mg/kg),NaCl组腹腔注射生理盐水。8小时后处死,迅速取组织以及血浆标本。所有的实验动物操作程序均符合NIH实验动物管理与使用指南,以及中国科学院实验动物管理规范所制定的标准;Westernblot检测相关蛋白质的表达1.组织蛋白质的提取称取大约30mg组织,放入1.5mlEP管中置于冰上并剪碎,分别加入200μl组织蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂),在超声细胞破碎匀浆机上将组织震碎(工作条件为on:2s\off:10s\time:10),将匀浆液放置于4°C摇床30min,4°C,12000g离心20min,留取上清,储存于-80℃低温冰箱保存备用。2.BCA微孔法测定蛋白质浓度(1)将冻干标准品用0.9%NaCl稀释成2mg/ml的储存液,然后稀释成以下的浓度梯度:2mg/ml、1.5mg/ml、1.0mg/ml、0.75mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.025mg/ml和omg/ml。(2)配置工作液,根据标准品以及样品数目,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B,混匀。(3)
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