il-2恢复缺失syntaxin11的nk细胞功能的机制及35kd颗粒酶b的分析-mechanism of il - 2 recovering nk cell function of syntax in 11 deletion and analysis of 35kd granulase b.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PAGE PAGE 1 英文缩略词表 GrB cDNA DMSO DNA FBS HEPES IL-2 NK PAGE PEC PBS PCR granzyme B Complementary deoxyribonucleic acid Dimethyl sulfoxide Deoxyribonucleic acid Fetal Bovine Serum Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid Interleukin-2 Natural killer cells Polyacrylamide gel electrophoresis Porcine endothelial cell Phosphate buffered saline Polymerase chain reaction 颗粒酶 B 互补脱氧核糖核酸 二甲基亚砜 脱氧核糖核酸 胎牛血清 羟乙基哌嗪乙磺酸 白细胞介素 2 NK 细胞 聚丙烯酰胺凝胶电泳 猪内皮细胞 磷酸盐缓冲液 聚合酶链反应 RT CFSE Reverse transcription Carboxy?uorescein succinimidyl ester 逆转录 羧基荧光素琥珀酰亚 胺酯 HLH hemophagocytic lymphohistiocytosis 噬血细胞性淋巴组织 细胞增生症 FHL familial hemophagocytic lymphohistiocytosis 家族性噬红细胞性淋 巴组织细胞增多症 K562 OD PFN PI PVDF Human erythroleukemia cell line Optical density Perforin Propidium iodide Polyvinylidene fluoride 人红白血病细胞株 吸光度 穿孔素 碘化丙啶 聚偏二氟乙烯 SDS siRNA Sodium dodecyl sulfate Small interfering RNA 十二烷基磺酸钠 小干扰 RNA IL-2 恢复缺失 syntaxin11 的 NK 细胞功能的机制及 35KD 颗粒酶 B 的研究 硕士研究生: 孙汝林 导师: 郑芳 副教授 龚非力 教授 华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学教研室 中 文 摘 要 Syntaxin11 是 FHL4 型疾病的病人所缺失的一种蛋白，其在 NK 细胞的胞吐 过程中具有重要的作用。该蛋白分子缺失时会对 NK 细胞的胞吐作用造成很大的 影响，进而影响 NK 细胞在天然免疫中的功能。这是 FHL4 型疾病的根本原因。 但是临床上对 FHL4 型病人进行治疗时，发现大剂量的 IL-2 可以有效的缓解病 人的情况，部分恢复 NK 细胞的杀伤活性。这为该疾病的治疗提供了一定线索， 本课题对大剂量 IL-2 恢复缺失 syntaxin11 的 NK 细胞的杀伤活性的机制进行了一 定的研究。 目的： 以缺失 syntaxin11 的 NK92 细胞为研究对象，观察大剂量的 IL-2 作用于缺 失 syntaxin11 的 NK 细胞部分恢复其杀伤活性的现象，探讨其中相关的调控机制。 方法： 首先，用 syntaxin11 siRNA 转染 NK92 细胞，干扰 syntaxin11 的表达。进而 观察 NK92 细胞内细胞毒性物质的含量，运输细胞毒性物质的相关分子的含量以 及 NK92 细胞分泌细胞毒性物质的能力的变化。 其次，为了解大剂量 IL-2 对缺失 syntaxin11 分子的 NK 细胞胞吐过程的影响， 我们构建了 Rab27a 表达载体。 最后，通过提取 NK92 细胞内的溶酶体蛋白、细胞浆蛋白和细胞器蛋白，以 及分别用 EGTA 和 BFA 对 NK92 细胞作用后，对不经溶酶体分泌的 35KD 的颗 粒酶 B 进行了一定研究。 结果： 1、建立了模拟 FHL4 型病人 NK 细胞的模型 Syntaxin11 siRNA 转染的 NK92 细胞内的 syntaxin11 分子基本上完全消失， NK 细胞杀伤靶细胞的能力下降。然后经过 300U/ml IL-2 刺激，NK92 细胞杀伤 靶细胞的能力恢复。 2、检测大剂量的 IL-2 作用的缺失 syntaxin11 的 NK92 细胞内的相应分子的含量 变化 300U/ml IL-2 刺激缺失 syntaxin11 的 NK92 细胞后，使其细胞内的 PFN 的 mRNA 含量，GrB 的蛋白含量和 syntaxin7 的 mRNA 含量增多。 3、DsRed C1-Rab27a 真核表达载体构建 成功构建 DsRe