不同尺度二氧化钛纳米颗粒的细胞毒性及其机制分析-cytotoxicity of titanium dioxide nanoparticles in different scales and its mechanism analysis.docx

摘要钛及钛合金因具有良好的力学性能和生物相容性，被广泛地应用为临床骨植入体。但是，由于其固有的表面惰性，钛基植入体只能通过机械锁合方式与周围骨组织整合。因此，在过去几十年中，科研工作者通过调控适宜的钛基材表面拓扑结构以期获得高性能钛基植入体。近年来，伴随着纳米技术的快速发展，利用纳米表面工程化钛基表面(纳米拓扑结构)调控细胞行为的研究备受关注。然而，在长期临床应用（例如，钛髋关节植入体）中，由于腐蚀、无菌性松动和假体摩擦，植入体/骨界面不可避免地会产生微米级或纳米级的磨损颗粒。本论文利用水热法合成了不同尺度的二氧化钛纳米颗粒，模拟钛合金植入体的纳米级的磨损颗粒，进而研究磨损颗粒对成骨细胞、骨髓骨间充质干细胞生长的影响，为研发新型钛基植入体积累知识。本文的主要研究内容和结论如下：1．不同尺度二氧化钛纳米颗粒的合成利用水热法合成了不同尺度的二氧化钛纳米颗粒。分别利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对一系列二氧化钛纳米颗粒的形貌进行了表征。结果显示，二氧化钛纳米颗粒具有均一的形态特征和较好的分散性。颗粒粒径分布分别为:14±3nm、39±8nm、74±15nm、108±23nm、136±34nm及196±50nm。X射线衍射仪表征证实：二氧化钛纳米颗粒呈高结晶度，晶相结构符合锐钛矿相(PDF21-1272)。2．200纳米以下不同尺度二氧化钛颗粒的细胞毒性与其尺度的相关性为了评价钛基全关节植入体产生的纳米尺度磨损颗粒对细胞的影响，在本文中，我们首先研究了不同尺度的二氧化钛纳米颗粒对成骨细胞生物功能的影响。细胞活力和碱性磷酸酶活性评价表明：纳米颗粒的负效应随颗粒尺度的增加而增大(p0.05，p0.01)。利用透射电子显微镜、溶酶体染色和激光共聚焦显微镜检测了纳米颗粒对细胞形态的影响以及在细胞中的分布。结果表明：二氧化钛纳米颗粒仅存留于细胞质中，而未进入细胞的细胞核中。利用吞噬抑制剂，我们进一步研究了不同纳米颗粒内吞机制。结果证实：不同尺度的纳米颗粒进入细胞的内吞作用的途径不同。最后，我们研究了不同纳米颗粒对成骨细胞核受体激活核因子κB配体（RANKL）的表达、基质金属蛋白酶MMP-9活性以及细胞凋亡的影响。研究证实：随着颗粒粒径的增加，负效应也随之显著增加。总之，所有数据表明，锐钛矿型TiO2纳米颗粒对成骨细胞的负效应随颗粒尺度的增加而增大，为纳米钛基植入体的安全性评价提供了依据。3.不同尺度二氧化钛纳米颗粒对骨髓间充质干细胞粘附、增殖、迁移和分化的影响为进一步研究钛基人工关节植入体的纳米尺度磨损颗粒对骨整合性的影响，我们从细胞水平到分子水平研究了不同TiO2纳米颗粒（模型）对骨髓间充质干细胞(MSCs)的粘附、迁移、增殖和分化的影响。MSCs的活力、增殖以及细胞周期呈现与TiO2纳米颗粒的尺度和使用的剂量相关(p0.01)。利用激光共聚焦显微镜考察了细胞内吞的纳米颗粒对MSCs的粘附、铺展及细胞形态的影响。研究结果证实，大尺度的TiO2颗粒严重破坏了MSCs的细胞膜的完整性、细胞骨架的铺展和粘着斑蛋白。Transwell分析和伤口愈合实验证明：随着TiO2纳米颗粒尺度的增加，对细胞迁移的不利影响越严重。此外，碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白的基因表达以及矿化测试表明，大尺度的TiO2纳米颗粒对MSCs的成骨细胞分化具有显著的负面影响。本研究积累的知识可为设计新型纳米结构的钛金属植入体提供思路。4.不同纳米颗粒的表面特征及化学性质对内皮细胞功能的影响本文中，我们合成了尺度为100nm左右的三种纳米颗粒（介孔SiO2、Fe3O4以及TiO2颗粒）。纳米颗粒的形貌、晶相以及表面电荷分别用扫描电子显微镜、X射线衍射仪及Zeta电位仪表征。进而，我们研究了不同纳米颗粒的形貌和表面电荷对内皮细胞功能的影响。研究表明：当纳米颗粒的浓度小于0.20mg/mL时，介孔SiO2和Fe3O4纳米颗粒的剂量依赖毒性不明显；但随着培养时间的延长，对细胞的负效应显著增加。在高剂量(0.20mg/mL)情况下，不同纳米颗粒对细胞的毒性表现出剂量和时间相关性。进一步检测乳酸脱氢酶(LDH)活性发现，纳米颗粒对细胞活力的影响表现与上述相同的趋势。通过透射电子显微镜观察表明，纳米颗粒的形状、表面电荷与颗粒的内吞途径和毒性相关。通过激光共聚焦显微镜观测发现，不同纳米颗粒导致细胞骨架形态及完整性破坏。其潜在机制在于不同纳米颗粒诱发过量的活性氧以及产生氧化应力，进而破坏细胞的线粒体，加速了细胞的凋亡及死亡。关键词：TiO2纳米颗粒，细胞毒性，粘附，迁移，活性氧ABSTRACTTitaniumanditsalloywerewidelyusedasboneimplantsinclinics,mainlyduetotheirgoodbiocompatibilityandmechanic