改性酵母葡聚糖制备及其作为免疫增强剂在两种甲壳动物上应用-preparation of modify yeast glucan and its application as immunopotentiator in two crustaceans.docx

改性酵母葡聚糖的制备及其作为免疫增强剂在两种甲壳动物上的应用摘要酵母葡聚糖是水产养殖中使用最广泛的免疫增强剂。但是目前的研究表明，葡聚糖的不溶解性不利于其免疫增强作用的发挥。为了增加酵母葡聚糖的溶解性，本研究共制备了8种酵母葡聚糖衍生物，即4种不同取代度的羧甲基葡聚糖和4种不同取代度的磺乙基葡聚糖。将葡聚糖和8种衍生物分别按照5、25和100μg/mL的浓度分别添加到原代培养凡纳滨对虾血细胞的培养液中。以空白血细胞作为对照。孵育6h、12h和24h后分别取样，测定血细胞的酚氧化酶和呼吸爆发活力。结果表明，在6h时，所有葡聚糖衍生物处理组的酚氧化酶活力均显著高于相同浓度下的未衍生葡聚糖处理组（P0.05）。而25μg/mL酵母葡聚糖衍生物处理组的呼吸爆发活力显著高于同浓度未经衍生葡聚糖处理组（P0.05）。在12h时，所有酵母葡聚糖衍生物处理组的酚氧化酶和呼吸爆发活力均显著高于未衍生葡聚糖处理组（P0.05）。在6h和12h时，同浓度各葡聚糖衍生物处理组的血细胞酚氧化酶和呼吸爆发活力并无显著差异（P0.05）。研究结果表明，羧甲基葡聚糖和磺乙基葡聚糖均比未衍生葡聚糖具有更强的免疫促进作用，而且这种免疫促进作用在两种衍生物之间没有显著差异；另一方面，酵母葡聚糖衍生物的免疫促进作用与其使用浓度有关，而与其取代度没有明显的关系。将葡聚糖及其8种衍生物分别按照1g/kg和2g/kg两种浓度添加到凡纳滨对虾饲料中，制备18种实验饲料。将这些饲料投喂给凡纳滨对虾（平均体重0.65g），饲养30天，取样测定免疫指标并用白斑病病毒攻毒，用以比较各免疫增强剂的免疫增强作用和免疫保护力。对于饲喂羧甲基葡聚糖的对虾，其总血细胞数、酚氧化酶活力、呼吸爆发活力、超氧化物歧化酶活力和攻毒后存活率显著受到取代度的影响，且随取代度的升高而下降。与羧甲基葡聚糖不同，磺乙基葡聚糖不能提高凡纳滨对虾血细胞数。磺乙基葡聚糖的取代度显著影响了凡纳滨对虾呼吸爆发活力。包含有1g/kg的葡聚糖衍生物的饲料比含有2g/kg的同一衍生物的饲料能显著的提高凡纳滨对虾的免疫力和抗病力。摄食含有1g/kg，取代度为0.352的羧甲基葡聚糖的凡纳滨对虾表现出最高的免疫力和抗病力。这种羧甲基葡聚糖可以作为更高效的凡纳滨对虾免疫增强剂。之前的研究表明，一些基因缺陷型酵母比野生型酵母具有更强的免疫促进作用。但是，基因缺陷型酵母的最适使用时间至今仍然未见报道。本研究选取两种基因缺陷型酵母（Mnn9和Chs3基因缺失酵母），连同野生型酵母（WT）在坎贝氏弧菌攻毒前48、24或12小时前分别投喂给卤虫。以攻毒后卤虫的存活率和酚氧化酶基因表达评价酵母种类和酵母投喂时间对于其的免疫保护和免疫促进作用的影响。实验结果表明，在任何时间点投喂野生型酵母都不能保护卤虫免受坎贝氏弧菌侵袭。攻毒前12小时投喂基因缺陷型酵母可以在一定程度上保护卤虫。延长投喂时间，并不能显著提高其免疫保护力。Mnn9和Chs3酵母的免疫保护力并没有显著差异。基因表达实验的结果表明，未攻毒时，所有酵母都不能影响酚氧化酶原基因的表达。但是，攻毒后12和24小时，基因缺陷型酵母可以提高酚氧化酶原基因的表达。本研究表明，攻毒前12小时使用基因缺陷型酵母即起到一定的预防疾病的效果。基于之前的研究，我们推测不同基因缺陷型酵母免疫保护力不同可能与其细胞壁的葡聚糖的性质有关。为了验证我们的推测，并为研究葡聚糖构象与功能的关系提供参考资料，我们从几种基因缺陷型酵母（Mnn9、Chs3、Gas1）和野生型酵母（WT）提取葡聚糖，并将购买于Sigma公司的酵母葡聚糖作为比照。将这5种葡聚糖投喂给无菌培养卤虫。12小时后，用坎贝氏弧菌攻毒，攻毒后于12、24、48和72小时测定卤虫的存活率和酚氧化酶基因的表达。实验结果表明，所有的葡聚糖都可以在一定程度上保护卤虫免受坎贝氏弧菌的侵袭。从Mnn9和Gas1提取的葡聚糖可以提供完全保护，而其它三种葡聚糖可以提供半保护。基因表达的结果表明，从Mnn9和Gas1提取的葡聚糖可以使卤虫酚氧化酶原基因的表达较长期的维持在较高水平。本研究证实了我们的推测：不同酵母提取的葡聚糖的免疫促进和免疫保护作用不同。关键词：酵母葡聚糖；化学改性；基因敲除；凡纳滨对虾；卤虫ModifiedyeastglucanpreparationanditsapplicationasimmunostimulantfortwocrustaceansAbstractYeastβ-glucanisawidelyusedimmunostimulantinaquaculture.However,theinsolubilityofβ-glucanisagainstitsimmunoenhancingeffects.Inthepresentstudy,carbo