selex技术筛选人tgf-βrⅱ亲和核酸库方法的建立-establishment of selex technique for screening human tgf - β r ⅱ affinity nucleic acid library.docxVIP

第三军医大学硕士学位论文 第三军医大学硕士学位论文 PAGE PAGE 6 SELEX 技术筛选人 TGF-β RⅡ 亲和核酸库方法的建立 摘 要 研究背景： 指数富集的配体系统进化 (SELEX) 技术系指在体外从人工合成的 ssDNA 或 RNA 随机序列库中寻找与靶分子特异结合片段的过程，其实质是试管中的 人工进化。筛选出的分子称为核酸适体(aptamer)。随机库中核酸分子空间构象的多样 性是核酸分子与其它分子相互作用的基础。核酸适体代表着一类功能与抗体相似的新 型分子，它的靶分子广、分辨率高、化学修饰便利、组织穿透能力强等特点，令其在 基础研究、临床诊断、药物研制方面得以广泛应用。目前，VEGF、癌细胞表面特定 蛋白 Nucleolin 及凝血酶的核酸适体已进入临床试验阶段。 TGF-βs 在纤维化病变的发生发展中起重要作用，其受体主要分三型：TGF-βRⅠ、 TGF-βRⅡ和 TGF-βRⅢ。TGF-βRⅢ主要负责将间质中的 TGF-βs 传递给 TGF-βRⅡ并 增强它们之间的亲和性。TGF-βRⅠ和 TGF-βRⅡ均属跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶受体家 族，其中 TGF-βRⅡ能自由地与 TGF-βs 结合，而 TGF-βRⅠ仅能识别配体与 TGF-βRⅡ 形成的复合物并被激活。激活的 TGF-βRⅠ可进一步磷酸化下游的信号分子如 Smad， 引起 Smad 向核内转位，从而介导 TGF-βs 的一系列生物学效应。因此，以 TGF-βRⅡ 蛋白为靶点筛选和研制其拮抗剂，封阻 TGF-βs 的生物学活性，对于纤维化病变的防 治具有积极意义。迄今为止，还未见 TGF-βRⅡ核酸适体的研究报道。本研究初步探 讨了利用 SELEX 技术从 ssDNA 随机库中富集 TGF-βRⅡ亲和核酸库的方法，为后续 分离 TGF-βRⅡ单一核酸适体，获取 TGF-βRⅡ新型拮抗剂奠定了基础。 材料与方法： 1. 初始 ssDNA 随机库的构建 设计中间含 60 个随机碱基、两端为固定序列、总长 108nt 的 ssDNA 模板，交由 公司合成。产品已做去保护及纯化处理。 2. SELEX 筛选 1) 首轮筛选：直接取适量合成的 ssDNA 做为初始筛选库(ssDNA-0)，初始库容量 为 1.2×1015。靶蛋白 TGF-βRⅡ与 ssDNA-0 温育后，反应混合液上样到硝酸纤维素膜 上，真空抽滤，洗脱游离核酸。7M 尿素、酚/氯仿回收膜上滞留的 ssDNA。行 PCR 扩增时，采用 5′端生物素化的下游引物，使 PCR 产物偶联上生物素。变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳纯化 PCR 产物。利用 Streptavidin-Agarose 捕获 dsDNA，0.15N 的 NaOH 使 双链变性，释放非生物素标记的 ssDNA，回收后用于第 2 轮筛选。 2) 第 2～4 轮筛选：将靶蛋白 TGF-βRⅡ预先吸附到固相基质 Phenyl-Agarose 上， 然后与 ssDNA 富集库温育，洗脱未结合核酸，回收与 TGF-βRⅡ结合的 ssDNA。扩增、 富集、分离目的 ssDNA 步骤同前。从第 3 轮筛选始，引入针对固相基质 Phenyl-Agarose 的反向筛选。 3) 第 5～8 轮筛选：与第 3～4 轮筛选相比，做两点调整：(1)反向筛选调整为： 富集库与预先吸附了 BSA 的固相基质 Phenyl-Agarose 温育。(2)筛选时，向筛选缓冲 体系中加入酵母 tRNA。随着筛选的进行，严谨度不断增加。 3. 监测富集库进化状态 1) 膜结合测定实验： 将 32P 放射性标记的初始库、富集库分别与 TGF-βRⅡ及 BSA 温育，反应混合液上样到硝酸纤维素膜上，负压抽滤，空气中干燥滤膜。液闪仪 计数 CPM 值。以百分值〔(核酸蛋白组膜上放射残留量－单纯核酸组膜上放射残留量)/ 投入反应核酸的放射总量〕×100％估算核酸库对靶蛋白的亲和程度。 2) 凝胶迁移阻滞实验：将 32P 放射性标记的初始库、富集库分别与 TGF-βRⅡ及 BSA 温育，反应混合液上样到 4％非变性聚丙烯酰胺凝胶中，电泳，放射自显影。 结果：第 8 轮富集库对靶蛋白 TGF-βRⅡ的亲和力较初始随机库提高了 22.61 倍， 有非常显著的差异(P0.01)。在第 8 轮富集库＋TGF-βRⅡ组泳道中观察到核酸-蛋白复 合物滞后带。同时，虽然第 8 轮富集库对 BSA 的亲和力较原始库亦提高了 11.33 倍， 但在凝胶迁移阻滞实验中观察不到 BSA/ssDNA 复合物滞后带，说明富集库 ssDNA-8 与 BSA 的结合系非特异性的。 结论：经过 8 轮循环筛选，终极富集库对靶蛋白 TGF-βRⅡ的亲和力获得了一定 程度的提高，确实向着特异亲