selex技术体外筛选单增李斯特菌适配子及其荧光快速检测方法建立-selex technique for screening aptamers of listeria monocytogenes in vitro and establishment of a rapid fluorescence detection method.docxVIP

SELEX 技术体外筛选单增李斯特菌适配子及其 荧光快速检测方法的建立 摘 要 目的：本文采用 SELEX 技术，以单核细胞增生李斯特菌为靶目标，筛选得到一组拥有 高亲和力和高特异性的寡核苷酸适配子，并初步建立单核细胞增生李斯特菌的荧光快 速检测方法。 方法： .以单核细胞增生李斯特菌为靶目标，人工合成两端为固定序列，中间含 37 个 随机序列，全长为 80nt 长度的 ssDNA 文库。应用 SELEX 技术进行反复 9 轮筛选，得 到一组高亲和力和高特异性的适配子群。为了减少 ssDNA 与其他细菌的交叉结合，在 第 5 轮用蜡样芽孢杆菌进行反筛，在第 7 轮用英诺克李斯特菌进行反筛。利用地高辛 -抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测各轮筛选产物与单核细胞增生李斯特菌的结合 率。 .最后一轮的筛选产物进行扩增、纯化，克隆、测序。应用 Chromas 2 软件分析 适配子的测序峰图，DNA MAN 软件对测序出来的适配子序列一级结构进行同源性分析， 并用 RNA Structure 软件预测序列的二级结构。 3.通过对适配子结合力和特异性检测，选取最佳的一条适配子，运用荧光结合机 制来设计分别标记有 FAM 和 TAMRA 的两种荧光适配子，初步建立荧光标记适配子直接 检测法（FLADA）。 结论： 1.随着筛选轮数的增加，筛选条件越来越严格，最终得到一组高亲和力和高特异 性的适配子群，初步建立了 SELEX 体外筛选单核细胞增生李斯特菌适配子的技术。利 用克隆技术成功的将筛选获得的适配子进行克隆，测序，并将得到的 18 条序列分为 A、 B、C 三组。A 组中的 15 条序列的随机区片段长度和预期片段的随机区长度一致，B 组中 2 条序列的随机区片段短于预期片段的随机区长度，C 组中的 1 条序列的随机区 片段比预期的多了一个碱基。运用 DNAMAN 软件分析 18 条克隆适配子一级结构的同源 性，除 H09 序列剩下的 17 条序列都有较高的同源性，说明经过 9 轮 SELEX 筛选，一 级结构同源的适配子得到了一定程度的富集。应用 RNA Structure 软件模拟适配子的 二级结构，以茎环结构为主。 2.利用地高辛-抗地高辛碱性磷酸酶显色体系对适配子的结合率进行测定，从得 到的18个克隆适配子中选取结合率最高的E01号适配子，并将E01号适配子与多种菌种 结合，进行特异性检测，E01号适配子与目标菌单核细胞增生李斯特菌的结合力远远 大于其他菌种，高达1.017，说明了E01号适配子的高特异性。 3.选择FAM和TAMRA两种荧光基团对E01号适配子进行标记，荧光显微镜下可以直 接观测到适配子与单核细胞增生李斯特菌孵育后有较强的荧光，而与蜡样芽孢杆菌和 英诺克李斯特菌结合的数量就很少。荧光标记适配子与我们目标菌的检测灵敏度可达 103 /ml。初步建立了荧光基团标记适配子快速检测单核细胞增生李斯特菌的检测方 法。 关键词：SELEX、核苷酸适配子、单核细胞增生李斯特菌、亲和力、荧光标记适配子 直接检测法（FLADA） In vitro selection of DNA aptamers and fluorescence-based recognition for rapid detection of Listeria monocytogenes ABSTRACT Objective: To screen high-affinity and high specificity aptamers to Listeria monocytogens by applying SELEX( Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method, and initially established a method for rapid detection Listeria monocytogens. Methods: The Listeria monocytogens as a target, a single stranded DNA random library with 80 nucleotides in length containing 37 random sequences was constructed. After nine rounds of SELEX selection, the high affinity and specificity of the aptamers with Listeria monocytogens were obtained and the counter-selection against Bacillus