蛇毒类激肽释放酶的制备及其生化特性与药效分析.docVIP

蛇毒类激肽释放酶的制备及其生化特性与药效分析 　　蛇毒是由毒蛇毒腺分泌的一类天然毒液,含有多种蛋白质、多肽、酶类和其它小分子物质,具有广泛地生物学活性,常作为天然药用资源库进行研究。随着药理学、毒理学和药物学的发展,蛇毒酶类在抗血栓、止血、镇痛、降压及抗肿瘤方面表现出很大的潜力。根据酶活力中心特点,蛇毒酶类分为丝氨酸蛋白酶类和金属蛋白酶类; 根据活性功能分为蛋白水解类、抗凝血类、促凝血类和激肽释放类。其中蛇毒类激肽释放酶,是与激肽释放酶性质相似的一类丝氨酸蛋白酶的总称,能作用激肽原生成激肽,具有扩张血管,改善微循环和调节血压等作用; 同时还可以作为活化因子,激活纤溶酶原,提高纤溶系统和胶原水解酶活性,起到防止血凝,抗血栓形成,该酶对开发为心脑血管疾病治疗药物具有重要的应用前景。目前对蛇毒类激肽释放酶的综述报道尚属空白,本文就其分布、分离制备、生化性质、药效研究以及此领域的研究进展等做一详细综述,为今后蛇毒类激肽释放酶的研究提供参考依据。 　　1、 蛇毒类激肽释放酶的分布 　　1948 年,Rocha 等首次在矛头腹 Bothrops jarara-ca 蛇毒中发现了类激肽释放酶,与血液共同孵育时表现为一种平滑肌舒张物质,而将其注入动物体内会引起血压的下降,此后激肽释放酶广泛在哺乳动物的血浆和胰脏等腺体组织中发现。迄今为止,研究人员已经在响尾蛇属、腹亚科、蝰亚科和眼镜蛇科等种属的30 余种毒蛇蛇毒中都分离得到了类激肽释放酶。Os-hima 等根据精氨酸酯酶及类激肽释放酶的活性,指出类激肽释放酶在腹亚科蛇毒中的活力最高。Abdus-alam 等研究了响尾蛇属、蝰亚科、眼镜蛇科等 15 种毒蛇蛇毒的激肽酶、酪氨酸酯酶、精氨酸酯酶及激肽释放酶的活性,指出所有响尾蛇属和蝰亚科蛇毒中都含有类激肽释放酶的分布,而在蝮亚科 Agkistrodon halysussuriensis 中活性较高,与前人研究结果一致。 　　2、 蛇毒类激肽释放酶的分离纯化及制备 　　传统的蛇毒酶类主要采用色谱法进行分离纯化,类激肽释放酶也是如此,包括离子交换色谱法和凝胶过滤色谱法,并结合亲和层析辅助纯化完成。常用的阴离子交换剂有 DEAE-葡聚糖凝胶和 DEAE-纤维素等,葡聚糖凝胶有 SephadexG-100 和 SephadexG-75 用作分离。随着分子生物学的发展,利用基因工程技术对蛇毒酶类进行重组表达的技术越来越成熟。目前已有多种蛇毒酶类获得了具有活性的重组表达产物,如来自南美洲矛头蛇毒中的降纤酶和止血酶 Batroxobin,菜花烙铁头蛇毒中的纤溶酶 Jerdonitin 和绿蝮蛇毒中的抗血小板凝集的金属酶 Albocollagenase 等。 　　相应的,蛇毒类激肽释放酶的重组表达也有相关研究。Huang 等将烙铁头蛇毒激肽释放酶基因与两个限制性内切酶切位点 BamH I、Pst I 和组氨酸标签基因构建克隆到载体 pQE30 后,转入 E. coli M15 中进行原核表达,表达产物经免疫杂交、液相色谱分析、电喷雾质谱和 N 端氨基酸分析验证,结果表明重组表达类激肽释放酶 Tm-5 与天然烙铁头蛇毒激肽释放酶结构一致,且对天然 Tm5 的底物 N-benzoyl-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilide 具有很高的活性,表明重组类激肽释放酶Tm 表达成功。Wang 等首次报道了将江浙蝮蛇蛇毒类激肽释放酶基因克隆到 pCS2 +表达载体后,转入小麦麦胚无细胞表达系统进行表达,通过对载体、RNA聚合酶浓度、磷酸肌酸和 Cu2 +等条件的优化,表达的重组表达激肽释放酶活性为 1. 3 U/mg,能达到天然蛇毒激肽释放酶活性( 1. 74 U/mg) 的 75%,得到了具有相对高活性的无细胞表达的类激肽释放酶,为无细胞表达载体的应用前景提供了依据。 　　3、 蛇毒类激肽释放酶的生化性质研究 　　哺乳动物体内有两种激肽释放酶: 组织型激肽释放酶和血浆型激肽释放酶。组织型激肽释放酶作用于高分子量激肽原和低分子量激肽原,均释放胰激肽,血浆型激肽释放酶只作用高分子量激肽原释放缓激肽。大部分来自腹亚科和响尾科蛇毒的激肽释放酶与血浆型激肽释放酶特异性一致,只作用于高分子量激肽原释放缓激肽,然而来自原矛头蝮属毒蛇蛇毒的 elegaxo-binⅡ与组织型激肽释放酶特异性一致,能够分别作用于高分子量和低分子量激肽释放胰激肽。激肽释放酶在哺乳动物体内都是酶原形式存在的,要经蛋白酶作用后剪切,去掉氨基端的 6 个氨基酸残基形成活性形式后才能发挥生物活性,而蛇毒类激肽释放酶与其不同,不需要激活,直接可以用于激肽原释放激肽,引起下游的生物学反应。 　　目前发现的类激肽释放酶均属于单体糖蛋白,分子量约为30 ~35 kD。糖链结构主要有海藻糖、己糖和唾液酸等,其所占蛋白