基于脂蛋白纳米载体的小干扰rna递送方法分析-analysis of small interfering rna delivery method based on lipoprotein nanocarrier.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□，在年解密后适用本授权书。不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月摘要1小干扰RNA（siRNA）能够沉默疾病相关基因的表达,但是如何有效地运输这些高负电荷的分子仍具有挑战性。寻找和开发无毒且高效的siRNA递送方法来实现特定的基因沉默一直是研究热点。天然脂蛋白（低密度脂蛋白LDL和高密度脂蛋白HDL）是内源性的纳米颗粒，作为药物载体已具有悠久的历史，而人工模拟脂蛋白是一种新型的、具有临床应用潜力的纳米载体。本文建立和发展了以LDL和仿HDL纳米颗粒为载体的siRNA递送方法，解决了siRNA的靶向运输和胞浆释放等问题，取得了以下研究结果*：（1）使用纯化的LDL纳米颗粒成功地实现了功能性siRNA的靶向递送。当siRNA共价耦联到胆固醇后，每分子的LDL上可装载超过25分子的胆固醇-siRNA（chol-siRNA），形成的复合纳米颗粒LDL-chol-siRNAs保持了LDL的形态、结构和功能。实验结果表明，LDL-chol-siRNAs能够经由LDL受体介导的内吞途径选择性地被细胞摄取，其基因抑制效率是单独使用chol-siRNA的2.1倍。然而，此方法有一定的局限性，因为受体介导的内吞途径使得LDL-chol-siRNAs主要蓄积在内体/溶酶体中，若能解决siRNA的胞浆释放问题，将有望获得更好的基因沉默效果。（2）提出采用光化学内化（PCI）法促进LDL运载药物的胞浆释放，发现PCI法对LDL表面装载的药物具有最佳的胞浆释放效果。我们使用三种不同类型的荧光染料以模拟化疗药物，通过不同的方法分别装载到LDL中，包括插入到磷脂单分子层外膜（表面装载），耦联到apoB-100蛋白的特定氨基酸上（蛋白标记法），重组进入LDL的脂质核心（核心装载）。荧光显微成像结果显示，这些载药的LDL纳米颗粒均是通过LDL受体介导的内吞机制进入人肺癌细胞A549中的。当联合使用PCI法后，通过比较光照前后细胞内荧光信号变化的倍数，显示出不同装载类型药物的胞浆释放程度：LDL表面装载的染料DiI释放量最大，脂蛋白耦联标记的染1基金资助：国家重大科学研究计划项目（2011CB910401），NSFC-CIHR中加健康研究合作计划（NSFC-30911120489,CIHRCCI-102936）料FITC释放程度次之，核心装载的染料Fluo-BOA胞浆释放效果不佳。此结果表明，PCI法诱导的LDL装载药物的胞浆释放，与LDL的载药方式密切相关，因而尤其适用于解决LDL表面装载chol-siRNA的胞浆释放问题。引入PCI法后，LDL-chol-siRNA的基因沉默效果随着光照的时间增加而提高，到最大光照时间为180s时，基因抑制效率从38%提高到78%。（3）利用HPPS（仿HDL纳米载体）靶向清道夫B类I型受体（SRB1）的机制，建立了一种新的纳米载药方法能将siRNA直接运输到细胞胞浆中。实验结果显示，每分子HPPS可有效地装载8分子的chol-si-bcl-2（胆固醇修饰的siRNA靶向bcl-2），形成的HPPS-chol-si-bcl-2纳米颗粒保持了良好的结构完整性和纳米颗粒的均一性，对SRB1高表达的细胞具有明显的Bcl-2蛋白表达抑制效果，而对SRB1低表达的细胞无此功能。通过荧光共聚焦成像和亚细胞碎片分离技术进一步证实，HPPS-chol-si-bcl-2在胞内的摄取涉及到一种直接的胞浆转运机制。与单独的chol-si-bcl-2相比，HPPS-chol-si-bcl-2在Bcl-2蛋白表达的抑制和促凋亡方面分别有4.8倍和2.5倍的增加。直接的胞浆释放机制和良好的生物相容性使得HPPS尤其适合于递送胞内活性的基因干扰药物。（4）成功地将靶向分子表皮生长因子（EGF）耦联到HPPS上，使得HPPS的靶向性由SRB1转换为EGF受体，拓展了HPPS在肿瘤靶向诊疗中的应用范围。建立了评价纳米颗粒靶向性的双色荧光标记方法，双色荧光成像证实装载有近红外荧光染料DIR-BOA