基因工程(基因工程的主要技术与原理-PCR技术)PPT.pptVIP

原因： 底物和引物的浓度已经降低， dNTP和DNA 聚合酶的稳定性或活性降低， 产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用， 非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用， 扩增产物自身复性， 高浓度扩增产物变性不彻底。 4、PCR 反应液的配制 常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA 聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在 反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发； PCR反应液体系通常有20ul、25ul、50ul和 100ul体系几种。 五、PCR技术的应用 1.PCR产物的克隆 DNA克隆(DNA cloning)：是指将外源DNA片段插 入到克隆载体形成重组的DNA群体，并转化到寄 主细胞进行复制繁殖,以便从大分子的DNA或DNA 片段混合物中纯化并分离出特定的DNA片段的实 验操作过程。 为使PCR产物能够方便地装载到克隆载体上，可以 在扩增过程中，在其两端添加限制性酶切位点。 1)在PCR产物两端添加限制性酶切位点 这种添加方式可以利用特定设计的引物通过扩增来 实现。 待克隆DNA S-primer 循环1 PCR扩增 酶切位点2 A-primer 酶切位点2 酶切位点1 循环2 循环3 酶切位点1 基 因 工 程 生物技术专业核心课程 淮阴师范学院 高清松 C 分子杂交技术 A 核酸的分离和纯化 B 核酸电泳 第三章 基因工程的主要技术及原理 E PCR技术 D DNA核苷酸序列分析 第五节 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction) 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) 1983年，由美国Kary Mullis发明的一种 体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法， 故又称为基因的体外扩增法，也可称为无 细胞分子克隆法。 1993年获诺贝尔化学奖。 发展历史 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。 1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。 Saiki等人又在黄石公园从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。 一、PCR技术的基本原理 1.基本要素 模板：待拷贝的DNA称为模板，它可以是双链DNA也 可是单链DNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。 引物：是DNA复制的先锋，就象结晶过程中的晶核， 引导DNA的合成。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷 酸作引物。 DNA聚合酶：DNA复制的动力，在dNTP等底物存在时 在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。 dNTP：DNA合成的底物。 2.PCR技术的基本原理 PCR技术是以DNA互补链的聚合反应为基础， 通过DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序 列复性杂交，由DNA聚合酶催化引物延伸,最 终获得特异DNA片段的体外扩增方法。 DNA模板 变性 退火 延伸 循环1 变性 退火 延伸 循环2 R F 1 3 2 4 变性 退火 延伸 循环3 1 2 3 4 二、PCR扩增的步骤 变性(denaturation)：系统加热至92℃-96℃，使 dsDNA解链成为ssDNA，且热变性不改变其化学性质； 退火(annealing)：降温至37℃-72℃，使引物与模 板的互补区相结合； 延伸(extension)：在72℃条件下，DNA聚合酶将 dNTP连续加到引物的3’-OH端，合成DNA。 这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20 -40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的 DNA片段。 三、PCR反应体系的组成 模板（靶DNA） 引物（两个） Taq DNA聚合酶 dNTPs 缓冲液 1．缓冲液 10mMTris·HCl，pH为8.3-9.0(室温)，而在延伸温度 （72℃）下，pH值接近7.2。 二价阳离子：一般使用Mg2+，有时使用 Mn2+，用于激 活DNA聚合酶的活性中心，一般以MgCl2的形式提供，标 准浓度为 1.5mM。Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性 和产率。 缓冲液中还含有50mM的钾离子。有些缓冲液中还加入 一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含G+C模板 的扩增效率。 2．脱氧核苷三磷酸(dNTP) 脱氧核苷三磷酸是DNA合成的底物，标准的PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTP，即dATP、 dTTP、dCTP和dGTP，终浓度一般为200mM（即饱 和浓度）。dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异 性和忠实性。 3、引物 (Primer) 引物：与待扩增的特定靶DNA区某一末端序 列互补的人工合