神经通路示踪技术 尼式染色PPT.ppt

神经组织的固定;其它固定剂： 酒精（alcohol） ： 使蛋白质脱水而致不可逆性的凝固变性。对组织有固定、硬化兼脱水的作用 醋酸（acetic acid）： 对核蛋白有明显的沉淀作用，不能单独使用，常与酒精联合使用 苦味酸（picric acid）： 沉淀蛋白并溶解粘蛋白，使组织柔软。 铬酸（chromic acid） ： 强氧化剂，能沉淀所有蛋白。重铬酸钾是氧化剂，对蛋白和脂类有固定作用，尤其是脂类。对核蛋白有溶解作用。 氯化汞（mercury chloride） ： 沉淀各种蛋白。但必须脱汞 锇酸（osmium tetroxide） ： 强氧化剂。蛋白的固定作用较好，不发生沉淀，组织几乎不收缩。但渗透力弱。 丙酮（acetone） ;（三）固定方法 1.浸入法 将组织浸泡在固定液内。 2.灌注法 此法适用于动物实验研究。;常用的切片方法;;;;5．冷冻干燥切片(freezing drying sectioning)：将新鲜组织放入经液氮预冷（-160℃）的异戊烷中骤冷后，入真空内干燥，已干燥的组织块进行真空包埋后切片。其特点是细胞在骤冷的同时立即停止一切生物化学变化，可研究骤冷时细胞内的物质变化状况。 6．超薄切片(ultrathin sectioning)：通过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤。固定分预固定和后固定。包埋剂多为环氧树脂。切片用醋酸铀及枸橼酸铅进行电子染色，在电子显微镜下观察。;神经组织的一般染色方法;Nissl染色程序： 切片入0.1%尼氏液中染色5至10分钟 蒸馏水洗去染液 70%酒精分色 1分钟 80%酒精 1-2分钟 90%酒精 1-2分钟 100%酒精 2分钟 100%酒精 2分钟 二甲苯 2分钟 二甲苯 2分钟 中性树胶封片;;;;;;;;⒉ 苏木精伊红染色法( hematoxyiln eosin，HE ) 本法是组织学最常用的染色方法，它可显示组织内各种细胞结构，HE染色在神经生物学研究中亦常采用，苏木精是阳离子染料，可将细胞核内的嗜碱性物染成蓝紫色，伊红是阴离子染料，可将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。;步骤: 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟; 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟; 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟 100%的酒精去二甲苯5分钟; 100%的酒精去二甲苯5分钟 90%的酒精水化2分钟; 80%的酒精水化1分钟; 70%的酒精水化1分钟 用蒸馏水洗; (以上步骤统称为脱蜡至水) 0．5%的苏???精染色，室温5—10分钟； 水洗； 1%的盐酸酒精分色30—60秒； 水洗； 流水促蓝；;1%的伊红室温染色2-5分钟； 水洗； 70%的酒精分色30—60秒； 80%的酒精脱水1分钟； 90%的酒精脱水1分钟； 100%的酒精脱水2钟； 100%的酒精脱水2钟； 二甲苯Ⅰ透明5分钟； 二甲苯Ⅱ透明5分钟； 中性树胶封片。 结果： 1．? 细胞质染成红色 2．? 细胞核染成蓝色 ;;⒊ Weigert 氏髓鞘染色法 有髓神经纤维的髓鞘主要组成成分是磷脂，如以铬盐或铁钒媒染使之与苏木精结合，再藉分色处理，就能着色清晰，并在中枢神经系统显示其分布状态。髓鞘染色除可用于显示神经纤维干、束外，更多用于中枢神经系统纤维束的追踪。因为，尚未髓鞘完全的纤维束（如婴儿皮质脊髓侧束），或髓化受到损害而产生溃变的纤维束，在与正常已髓化的纤维对比之下可以区别。用劳克坚牢蓝（Luxol fast blue）类染料染色也可显示髓鞘，操作时也较容易。但染色作用较慢，染色也较浅。;⒋ 镀银法（silver impregnation ） 镀银法又名浸银法，是用硝酸银镀染神经元，一个多世纪以来，镀银法为神经形态学的发展作出了重大贡献，此法于上一世纪七十年代由意大利解剖学家Golgi创建，故称为Golgi氏法。到目前Golgi原法己有许多改良法，经Cox改良的Golgi-Cox法，可以较好地显示神经元胞体、突起各部形态，是多年来较受欢迎的方法之一。;;神经细胞化学性质显示方法;（3）显示脂类的脂溶性染料法 显示脂类通常用易溶于脂类的染料，使之溶于组织或细胞内的脂滴内而显色. 常用的这类染料有: 苏丹III (Sudan III)，苏丹IV (Sudan IV)，苏丹黑B (Sudan black B)，油红O (oil red O)等。 （4）显示酶的酶细胞化学方法 酶显示法是显示酶的活性而不是酶的本身，细胞内含有多种酶，每一种酶都可催化一定的化学反应。酶显示法的基本原理是具有酶活性的组织切片或涂片，在含有酶作用底物和捕获反应产物的捕捉剂的孵育液中，经一定pH及一定温度的孵育，底物被酶催化分解后形成的初级反应产物被捕捉剂捕捉，并在原位沉淀，形成有色的最终产物。 ;2．免疫细