第7章 现代生物技术(一)PPT.pptx

人工基因组的设计与合成;第七章 现代生物技术(一);第七章 现代生物技术(一);DNA重组;;自然基因重组的方式;4．转座：指可移动的DNA序列（游动基因） 从基因组的 一处移动到另一处 的过程。 a.插入序列：转座酶基因＋反向重复序列 b. 转座子 定义：可从染色体一个位点转移到 另一位点的分散的重复序列。;DNA重组的类型;同源重组 ;;4. 游离端交叉连接，形成Holliday 结构 5.通过分支迁移产生异源双链DNA。 ;6. 空间重排。十字型两臂旋转180度 7. 解离(两种不同方式) 8. 修补连接 ;位点特异性重组;（三）催化重组的酶 1、整合酶 Int (integrase)：有拓扑异构酶活性 2、整合宿主因子（IHF，integration host factor ） 3、切除酶（excisionase）/ 终止重组 （四）重组位点： 附着位点（attachment site） attP（ POP’）和attB（ BOB’）有15bp核心序列配对 （五）重组过程： 1、整合： POP’ + BOB’ →BOP’—POB 2、切离：BOP’—POB’ → POP’ + BOB’ ;;attP;DNA的转座;DNA的转座;DNA的转座;人工DNA重组技术;DNA重组技术;重要的工具酶;限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE) 是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据限制酶作用特性，一般分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型， 其中常用的是Ⅱ型限制酶。 ; 限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点 特异识别及切割4?8个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构： 5ˊ－粘性末端 3ˊ－粘性末端 平端或钝端 回文序列(palindrome) 是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复; 粘性末端(sticky end) 是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。;⑴ 产生5-粘性末端; ⑶ 产生平(头末)端/钝端;同裂酶 ;同裂酶——同识同切;同裂酶——同识异切; 同尾酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。;可变酶; 常用限制性核酸内切酶的特性;34;DNA聚合酶; ㈠ DNA聚合酶Ⅰ ; DNA pol Ⅰ应用;E. coli DNA pol. Ⅰ催化缺口平移;㈡ Klenow片段（DNA pol.大片断）; Klenow片段用途; ㈢ Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）;三、逆转录酶(reverse transcriptase); 逆转录酶的应用： ⑴ 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库； ⑵ 补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段； ⑶ 代替Klenow酶用于DNA序列分析； ⑷ 制备杂交探针等。;DNA连接酶(DNA ligase) ;碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） ;末端 （脱氧核苷酸）转移酶(TdT) ;重要的工具酶;目的基因的获取;（一）制备基因组DNA（基因文库， genomic library ） 分离、纯化基因组DNA 在EDTA等存在下，用蛋白 ↓RE 酶K消化细胞、酚抽提； 大小不同酶切片段 常用蔗糖梯度离心或电泳 　　　↓ 　　　　　　　　　　　　分离酶切片断； 分别与同样RE酶切的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体 ↓ DNA连接酶连接； 导入宿主细胞、扩增 导入宿主细胞内培养、扩增； ↓ 得到分子克隆混合体 用分子杂交等方法进行鉴定、 （基因文库） 筛选、再扩增，分离、回收。