简第四章 基因工程制药(二)PPT.ppt

四章 基因工程制药 63页，共97页 四章 基因工程制药 64页，共97页 四章 基因工程制药 65页，共97页 第十节 基因工程药物的分离纯化 基因工程产品的特点； 分离纯化的基本过程； 分离纯化的技术； 选择分离纯化方法的依据。 四章 基因工程制药 66页，共97页 一 基因工程产品的特点 多数是活性肽或蛋白质，有下列特点： 含量较低； 发酵醪液组成复杂； 目的产物稳定性差； 表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异； 对其质量要求纯度高、无菌、无热原。 四章 基因工程制药 67页，共97页 二 分离纯化的基本过程 主要流程包括： 细胞破碎； 固液分离； 浓缩与初步纯化； 高度纯化直至得到纯品； 成品加工。 流程如P47图2—8所示。 四章 基因工程制药 68页，共97页 四章 基因工程制药 69页，共97页 三 分离纯化的技术 分离纯化技术应满足下列要求： 条件温和； 选择性好； 收率高； 两个技术之间能直接衔接； 整个过程快。 四章 基因工程制药 70页，共97页 （一）细胞破碎与固液分离 细胞收集：离心法、膜分离法； 细胞破碎： 机械破碎法：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法； 非机械破碎法：酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。 固液分离： 离心； 过滤； 双水相萃取（如乙二醇－无机盐等）。 四章 基因工程制药 71页，共97页 （二）目的产物的分离纯化 蛋白质分离纯化方法（根据理化性质和生物学特性）； 主要层析分离方法。分为离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶层析等； 。 四章 基因工程制药 72页，共97页 （三）非蛋白质类杂质的去除 纯化过程中，需特别注意3种可能存在的非蛋白类杂质： DNA； 热原质； 病毒。 具体除去方法见课本P61。 四章 基因工程制药 31页，共97页 一 基因工程菌的培养过程 基因工程菌的培养过程主要包括： 摇瓶：了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响； 培养罐：确定培养参数和控制的方案以及顺序。 四章 基因工程制药 32页，共97页 二 基因工程菌常用的培养方式 分批培养（batch culture）； 补料分批培养（fed batch culture）； 连续培养（continuous culture）； 透析培养（dialysis culture）； 固定化培养（immobilized culture）。 四章 基因工程制药 33页，共97页 分批培养 DO-Stat方法： DO控制在20％（搅拌转速、通气速率）； Balanced DO-Stat方法： 乙酸维持在低浓度（DO、搅拌转速、糖的流加速率）； 糖的流加速率和DO的平衡。 控制菌体比生长速率： 葡萄糖流速； 搅拌转速。 四章 基因工程制药 34页，共97页 连续培养 以一定稀释率进行不间断培养； 基因工程菌的不稳定性—连续培养困难； 解决办法：生长阶段和基因表达阶段分开，两阶段连续培养，第一阶段质粒稳定，第二阶段获得最高表达水平或最大产率。 关键的控制参数：诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。 四章 基因工程制药 35页，共97页 补料分批培养 培养一段时间后，间歇或连续补加新鲜培养基； 根据生长规律，通常控制溶氧和流加补料结合。 四章 基因工程制药 36页，共97页 透析培养 原理：利用膜的半透性使培养物和培养基分离； 目的：去除代谢产物如乙酸等对工程菌生长和外源基因表达的影响； 膜、透析液、时间等； E.coli—青霉素酰化酶（11倍）。 四章 基因工程制药 37页，共97页 固定化培养 基因工程菌培养的一大难题：维持质粒的稳定性。 固定化技术应用：固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。 四章 基因工程制药 38页，共97页 三 基因工程菌的发酵工艺 与传统的微生物发酵工艺的区别： 生物材料方面：基因工程菌带外源重组载体； 生产目的方面： 基因工程菌生产的目的是使外源基因高效表达，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。 基因工程菌发酵对营养要素和环境条件的需求与宿主菌有共性之处，但也有特殊的需求。特殊需求往往比共性需求更重要，更难满足，经常是制约产业化的重要因素。 四章 基因工程制药 39页，共97页 四 培养基组成与控制 培养基 组成 碳源 选择剂 诱导物 无机盐 氮源 其他 生长 稳定 四章 基因工程制药 40页，共97页 碳源 常用碳源：葡萄糖（比生长速率大，副产物多）、甘油（得率大）、乳糖（lac诱导）、甘露糖（不产乙酸，比生长速率大）、果糖等； 酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质； 单糖、双糖及其他有机物如甘油： 低浓度对菌体