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黑素细胞中GPNMB与Tyr相互作用探讨 　　[摘要]目的：探讨非转移性黑色素瘤糖蛋白B（glycoprotein （transmembrane） nonmetastatic melanoma protein b，GPNMB）与酪氨酸酶（tyrosinase）的相互作用。方法：以黑素细胞系PIG1为研究对象，分别构建GPNMB和Tyr的siRNA以及过表达载体，转染入细胞后采用实时定量RT-PCR、Western blot检测GPNMB表达下调和上调对Tyr的影响，以及Tyr表达下调和上调对GPNMB的影响；采用免疫共沉淀法检测它们之间的直接相互作用。结果：GPNMB表达下调和上调对Tyr有影响，而Tyr表达下调和上调对GPNMB几乎没有影响。结论：黑素细胞中GPNMB与Tyr之间不存在直接相互作用，为进一步研究GPNMB在黑素小体形成中的作用机制奠定了基础。 　　[关键词]黑素小体；黑素细胞；非转移性黑色素瘤糖蛋白B；酪氨酸酶 　　[中图分类号]R329.2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）04-0459-05 　　黑素细胞是一种皮肤里的特殊细胞，它可以产生黑色素，防止阳光对人体皮肤的辐射导致的细胞染色体受损。黑素小体是黑素细胞特有的膜性细胞器，是合成和储存黑色素的亚细胞结构，它的形成按其成熟程度不同可分成四个时期：I期黑素小体即前黑素小体，它含有很多低电子密度的囊泡；Ⅱ期黑素小体呈椭球形，内有沿长轴平行排列的纤维丝；Ⅲ期黑素小体其内部纤维丝上沉积着黑色素；Ⅳ期黑素小体其纤维丝被黑色素完全掩盖[1]。黑素小体生成或转运异常与色素相关疾病的发病机理有着密切联系，如白化病、白癜风等。现普遍认为Tyr在黑素小体的生成中起着重要调控作用[2-4]。GPNMB是一种细胞表面蛋白多糖。同时，它也是一种黑素小体特异性结构蛋白[1]，经研究发现，它在黑素小体的形成过程中也起着重要作用。GPNMB被siRNA基因沉默后，黑素小体的形成受到抑制，同时，Tyr的表达量显著下降[5]。虽然，Tyr表达量的变化会影响黑素小体的形成[2]，但它对GPNMB的表达有无影响，目前尚不清楚。因此，本研究拟探讨GPNMB与Tyr之间的相互作用，为深入了解GPNMB在黑素小体形成中的作用机制奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞：人来源的传代稳定的黑色素细胞系PIG1，由芝加哥洛约拉大学Caroline Le Poole 教授惠赠。 　　1.1.2 主??仪器及试剂：CO2细胞培养箱（Binder，德国），JEM-1200EX型透射电子显微镜（JEOL，日本），Bio-Rad iQ5实时定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国），CellTiter-BlueR Cell Viability Assay试剂盒（Promega，美国），BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液（碧云天生物技术研究所，南通），ECL化学发光试剂盒（Boehringer Mannheim，德国），RNAiso plus kit、PrimeScriptR RT reagent kit、SYBRR Premix Ex TaqTM II kit，限制性内切酶EcoRI、XhoI，T4连接酶（Takara，大连），Lipofectam ineTM RNAiMAX（Invitrogen，美国），抗酪氨酸酶抗体、抗β-肌动蛋白抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG （北京博奥森生物技术有限公司，北京），载体pMD19-T、pcDNA3.1（+），PE（Phycoerythrin）偶联的羊抗兔IgG（Invitrogen，美国），抗GPNMB抗体（Abcam，美国），M254培养基、胎牛血清（FCS）、S-002添加剂（GIBCO BRL，美国）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养及收集裂解细胞：培养PIG1细胞系，培养环境：M254细胞培养液（内含5%胎牛血清及S-002添加剂），5%CO2、37℃恒温培养箱。吸收培养基，加入PBS将细胞吹起后收集细胞，用裂解缓冲液重悬细胞，冰上放置30min，离心去沉淀，上清液用于免疫共沉淀实验。 　　1.2.2 RNA的提取与实时定量RT-PCR：采用RNAiso plus kit试剂盒提取PIG1细胞中的总RNA，按照试剂盒要求操作。按实验室常规方法进行PCR扩增。定量PCR采用的体系为：dNTPs 2μl，10×buffer 5μl，上下游引物各10pmol，Pfu酶0.5μl，模板2μl，加三蒸水至总体积50μl；扩增条件为：预变性94℃ 5min，进入循环，变性94℃ 1min，退火60℃ 1min，延伸72℃ 3min，30个循环后，72℃延伸5 min。