生物分离工程含体复性.ppt

包含体的复性 基因工程产品目前的研发状况 目前基因表达的重组蛋白质已超过4000多种,其中用E.coli表达的要占90%以上,而这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以包含体形式存在； 用于临床的基因重组药物只占研发药物的约1%。 存在的主要问题 复性效率低：常用的复性方法—稀释和透 析法的复性效率为5-20%； 与杂蛋白分离困难，产品成本高。 包含体 包含体是指外源基因在宿主细胞中表达时，表达的蛋白质不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1-3.0μm的固体颗粒-包含体。这些基因表达产物的一级结构(即氨基酸序列)虽然正确，但其立体结构是错误的。 由于包含体具有很高的密度(约1.3mg/mL ) 它们在细胞裂解后可通过低速离心收获。 包含体形成的原因 1. 蛋白质高效表达的结果 在载体系统中采用强的启动子和增强子序列,靶蛋白质表达分别可占细胞总蛋白的40%～50%，蛋白质的合成速度太快，肽链来不及折叠形成正确构象，导致分子间疏水基相互作用聚合而不溶。 2.宿主内缺乏目标蛋白质正确折叠的辅助因子 对于大肠杆菌,来源于真核细胞的蛋白质是一种外界刺激因子,在进化过程中细菌细胞还没有形成与之完全相适应的结构基础和折叠机制,例如,处于还原环境的细菌胞质不能有效地完成二硫键蛋白质的氧化折叠;又如,辅助肽链折叠的分子伴侣和折叠酶的种类和功能不能完全适应较复杂真核蛋白质的折叠。 如何使包含体复性？ 1，先用化学试剂将包含体溶解成为伸展的蛋白质一级结构；常用变性剂尿素、盐酸胍以及去污剂SDS等，可分别破坏蛋白质的高级结构及肽链之间的疏水作用，使其变成松散的水溶状态。 2，使蛋白质的一级结构在合适的条件下重新折叠成正确的构象。 蛋白质的重折叠机制 U ? I1 ?I2 ?···IZ ?IC IN N AC A 聚集：是由暴露在溶剂中的疏水区相互作用的过 程，速度快，一般在30秒内完成。 复性：分子链内自我折叠的过程，相对缓慢，完 全复性大约需10分钟的时间。 溶菌酶处理→高压匀浆破碎 → 低速离心 包含体沉淀需用去污剂(Triton X-100 或脱氧胆酸钠) 和低浓度变性剂(如2 mol/L 尿素或盐酸胍等) 洗涤以除去脂类和膜蛋白。 通过以上制备可获得高纯度的包含体(纯度高于70%)。 1. 用膜透析法或凝胶过滤去除变性剂，也可用稀释的方法，一般1-20?mol/ml的低浓度条件下，重组蛋白的复性效果较好。 对小分子的多肽，复性效率较高，对大分子蛋白和二硫键较多的分子，复性很困难。 2. 加入分子伴侣 人工分子伴侣体系(去污剂＋环糊精) 环糊精与直链糊精辅助蛋白质复性 分子伴侣：就是在细胞内催化及维持其他蛋白质 正确构象的一类蛋白质，它参与细胞 内许多蛋白质的折叠、聚合及跨膜运 输，通过瞬时稳定其他蛋白质折叠中 间体，阻止了蛋白质中间体聚集，帮 助其形成正确的构象。 其复性过程分为两步进行：第一步为捕获阶 段，在变性蛋白质溶液中加入去污剂，去污剂分 子通过疏水相互作用与蛋白质的疏水位点结合形 成复合体，抑制肽链间的相互聚集；第二步剥离 阶段，加入环糊精，由于环糊精分子对去污剂分 子有竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离下来， 从而使多肽链在此过程中正确折叠为活性蛋白 质。 环糊精的疏水性空腔能够结合变性蛋白质多 肽链的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活， 从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质。 直链糊精基本上能够模拟环糊精在辅助蛋白 质复性方面的作用，而且具有这样一些优点：直 链糊精的螺旋结构形成一个疏水性空管，可以结 合更多的蛋白质分子；在水中溶解度较高，有利 于提高复性酶浓度和实验操作；价格比环糊精便 宜，实际应用前景较好。 存在的问题： 分子伴侣在实际应用中尚存在费用高并需要与复性蛋白质分离等缺点，目前，分子伴侣还处于研究阶段，没有真正用于工业规模的包含体复性。 蛋白质的色谱复性及其纯化 液相色谱是纯化蛋白质的一个必不可少的手 段。其原理是根据待分离物质与色谱固定相之间 作用力的不同而得到分离。利用色谱复性正是利 用了变性的蛋白质在色谱固定相上的吸附作用而 避免了分子间的聚集作用，在吸附-脱附-吸附的 过程中实现了蛋白质的复性。 色谱