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凡纳对虾crustin 2基因序列及结构分析 　　摘要：以凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）crustin 2基因为研究对象，通过基因克隆、氨基酸序列比对、系统进化树分析以及分子结构的初步预测。结果表明，crustin 2基因可能在凡纳对虾的先天免疫系统中发挥着重要的抗菌功能，是一个重要的免疫效应基因。 　　关键词：凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）；crustin 2基因；克隆；分析 　　中图分类号：S917.4；Q781 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4526-03 　　凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）具有良好的抗菌、抗病毒等遗传特性。其先天免疫系统一直是研究热点，科研工作者试图通过研究抗菌、抗病毒相关的基因来发现凡纳对虾优良性状的分子生物学基础[1]。本研究以凡纳对虾crustin 2基因为研究对象，克隆了该基因的cDNA序列，并对基因序列的同源性、分子进化上的亲缘关系、初级结构等进行了分析。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　凡纳对虾购自于包头市友谊水产市场，并于超净工作台中剖取凡纳对虾肝胰腺、鳃等组织，用于提取总RNA。 　　1.2 方法 　　1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成 参照说明书，利用TRizol总RNA提取试剂盒提取凡纳对虾的肝胰腺和鳃等组织的总RNA[2]，于-80 ℃冰箱中保存备用。按照cDNA第一链合成试剂盒的操作说明书，将总RNA逆转录为cDNA。 　　1.2.2 目的片段的PCR扩增 以提取的凡纳对虾的总RNA反转录成的cDNA为模板进行PCR扩增[3]。利用前引物F和反转录使用的后引物3′ anchor R引物配对，来扩增目的基因的ORF的3′端序列；同时利用后引物R和反转录使用的前引物5′ PCR primer引物来扩增目的基因ORF的5′端序列，通过已有的中心片段以及两端片段拼接来获得基因的完整cDNA序列。 　　1.2.3 重组载体的构建与序列测定 使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因PCR扩增产物，将目的基因回收、纯化之后，参照T载体PCR产物克隆试剂盒使用说明书，将目的基因片段克隆到T载体中，经过蓝白斑筛选后，进行序列测定[4]。 　　1.3 生物信息学分析 　　1.3.1 氨基酸序列比对 将凡纳对虾crustin 2基因的cDNA序列进行比对。用Expasy在线软件对crustin 2基因进行翻译，预测蛋白质序列信号肽和结构域；氨基酸序列比对利用分子生物学软件DNAMAN完成[5]。 　　1.3.2 系统进化树的绘制 根据凡纳对虾crustin 2基因序列比对的结果，选择物种相近的生物的crustin 2基因，利用分子生物学软件MEGA 4.0进行系统进化树的绘制[6]。 　　1.3.3 分子结构的预测 根据Expasy在线软件对凡纳对虾crustin 2基因序列进行翻译的结果，利用SMART网站中蛋白质分子初级结构域预测工具进行分子结构的初步预测。 　　2 结果与分析 　　2.1 基因克隆和序列分析 　　以凡纳对虾各组织的总RNA反转录的cDNA作为模板，利用特异性引物F和R以及反转录过程中使用的引物5′ PCR primer和3′ anchor R扩增凡纳对虾crustin 2基因cDNA序列。结果（图1）表明，凡纳对虾crustin 2基因cDNA序列的ORF长度为456 bp，编码151个氨基酸；并且在ORF的下游2 bp处存在一个加尾信号AATAA序列。在氨基酸序列中，N端的18个氨基酸组成了信号肽序列，靠近C端的49个氨基酸形成了一个经典的WAP结构域，其中包括了8个保守存在的半胱氨酸。在信号肽序列与WAP结构域序列之间，存在着富含甘氨酸的基序以及保守存在的另外4个半胱氨酸。 　　2.2 氨基酸序列的同源性分析 　　将克隆得到的凡纳对虾crustin 2基因（Lva-crustin 2）cDNA序列，进行基因序列BLAST比对，选择了cDNA序列同源性较高的5种相近物种的crustin基因，进行氨基酸序列的同源性比对分析。结果表明，巴西美对虾（Farfantepenaeus brasiliensis）crustin基因（Fbr-crustin）、小褐美对虾（Farfantepenaeus subtilis）crustin基因（Fsu-crustin）、南美蓝对虾（Penaeus stylirostris）crustin基因（Pst-crustin）、大西洋白对虾（Litopenaeus setiferus）crustin基因（Lse-crustin）、斑节对虾（Penaeus monodon）crustin基因（Pmo-cr