产甘露聚糖酶解淀粉芽孢杆菌筛选鉴定及产酶条件优化.docVIP

产甘露聚糖酶解淀粉芽孢杆菌筛选鉴定及产酶条件优化 　　摘要：从海底淤泥中筛选出一株产高活性β-甘露聚糖酶的菌株，经16S rDNA序列分析表明，该序列与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rDNA序列同源性为100%，将该菌株命名为Bacillus amyloliquefaciens T27。对该菌株产酶条件进行了优化，以魔芋粉为碳源，酵母粉为氮源，装液量为50 mL，250 r/min、37 ℃培养24 h，发酵液中粗酶活力能达到98.0 U/mL。 　　关键词：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；甘露聚糖；甘露聚糖酶 　　中图分类号：TQ925+.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3105-04 　　目前，在全球能源危机、粮食缺乏及环境保护越发重要的情况下，甘露聚糖酶在食品、造纸、印染、纺织等许多方面都具有重要作用[1-4]。β-甘露聚糖酶能特异性水解甘露糖类半纤维素，产生大量甘露寡糖和少量甘露糖[5]。该酶广泛存在于植物、动物、微生物中[6]，其中微生物来源的甘露聚糖酶具有易于大规模生产、来源稳定、生产成本低等特点，因此，寻找发掘能够产甘露聚糖酶的微生物资源备受人们关注。由于工业生产中要求所使用的甘露聚糖酶具有较强的稳定性、耐热性及耐酸碱等特性，普通土壤环境下微生物产生的酶很难满足这一要求。海洋尤其深海环境特殊，包括了高压、低温、高盐、极端pH等，这一特殊环境中蕴藏着大量的稀有微生物资源。由于深海微生物产生的酶往往具有耐高温、耐高压和耐盐碱等特点[7]，在一些较为苛刻的工业环境中表现出极大的应用价值。因此，从海洋微生物中发掘新的酶资源受到越来越多的关注。 　　本研究从海底淤泥中筛选到一株产甘露聚糖酶的海洋细菌，经分子生物学鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），并初步研究了该菌株的最佳产酶条件，为进一步利用该海洋菌株生产甘露聚糖酶奠定了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 样品与试剂 海底淤泥样品取自厦门深海；Taq DNA聚合酶、PCR试剂、DNA Marker等均购自宝生物工程（大连）有限公司；槐豆胶、低熔点琼脂、蛋白胨和酵母粉购自英国Oxoid公司；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；其??试剂均为分析纯。 　　1.1.2 培养基 　　1）选择培养基。魔芋粉20.0 g，酵母膏20.0 g，NaCl 6.0 g， MgSO4·7H2O 1.0 g， KH2PO4 1.0 g，（NH4）2SO4 2.0 g，蒸馏水1 000.0 mL，pH 7.5。 　　2）种子培养基（LB培养基）。蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母膏5.0 g，蒸馏水1 000.0 mL，pH 7.2。 　　1.2 方法 　　1.2.1 产甘露聚糖酶菌株的筛选与鉴定 取约2 g泥样加入到100 mL蒸馏水中浸泡2 h左右， 取适量泥样悬液稀释， 不同浓度梯度分别涂布在固体选择培养基上， 37 ℃倒置培养2 d后，用0.1%刚果红染色10 min后弃去染液，用蒸馏水洗脱，选出透明圈直径与菌落直径比值大的菌株[8]。将筛选出的甘露聚糖酶高产菌株在LB固体培养基上划线培养，挑取单菌落于LB液体培养基中，28 ℃培养12～16 h，提取细菌基因组DNA。以基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物（fP1：5′-AGAGTTTGAT 　　CCTGGCTCAG-3′，rP2：5′-ACGGCTACCTTGTTACG 　　ACTT-3′），PCR扩增所筛选出菌株的16S rDNA， PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。将测序（测序交由华大基因公司完成）后的序列通过与GenBank中登录的基因序列进行BLAST比对，确定筛选出的菌株的种属。 　　1.2.2 甘露聚糖酶的活力测定 采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖含量[9]。取10 μL甘露聚糖酶加入到90 μL 0.5%槐豆胶底物，55 ℃反应30 min，然后加入100 μL DNS终止反应，沸水浴10 min，冷却后加蒸馏水定容至1 mL，再取200 μL加至96孔板中，测定OD540 nm。 　　1.2.3 产甘露聚糖酶菌株产酶条件的优化 ①培养时间对产酶的影响。250 mL三角瓶装入50 mL液体选择培养基，接种2%的种子培养液，置于37 ℃的摇床，转速为250 r/min培养12、24、48 h取样测