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哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得进展分析 　　摘 要：在目前制药领域，利用哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物取得了积极进展，哺乳动物细胞制备的蛋白质药物以其具有与天然蛋白质相似的特性而取得了重要应用。从蛋白质药物制造技术发展来看，考虑到哺乳动物细胞培养制备的蛋白质药物质量较高，并且制备过程难度低、制备成本不高，由此决定了哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物将在未来的制药领域取得全面发展和应用。基于这一认识，我们应认真总结哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得的进展，并深入探讨哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物技术的发展前景，做好哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物的研制工作。 　　关键词：哺乳动物细胞；培养制备；充足蛋白质药物；进展分析 　　1 前言 　　在近年生物制药发展中，利用哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质已经成为了重要的发展方向。研究表明，哺乳动物细胞培养制备的蛋白质，无论是在制备质量上，还是在蛋白质含量上，都达到了药用标准，并且在性能上也与天然蛋白质较为接近。基于这一优势和特点，关于哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物的研究得到了有效开展，并取得了积极的研究效果。结合目前关于哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物的现状，该研究在重组细胞系、重组表达载体和生物制备过程中取得了积极进展。 　　2 哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组细胞系中取得的进展 　　COS细胞曾是进行外源基因表达研究中用途最广的宿主，但由于其严重的贴壁作用，限制了大规模悬浮培养的实际应用。目前哺乳动物细胞生产重组蛋白中，常用的细胞系有CHO和HEK293两大类细胞。CHO是目前生物工程上广泛使用的细胞。该细胞属于成纤维细胞，本身很少分泌内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利，是表达复杂生物大分子的理想宿主。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞及CHO/dhfr-细胞，被广泛地用于重组DNA蛋白的稳定表达生产。HEK293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，它易于转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。利用瞬时基因表达方法，采用悬浮培养系统，可以快速、方便地获得mg级蛋白。 　　目前还有一些哺乳动物细胞株正在进行大规模培养生产的研发中，如来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株（MDCK）、红系细胞株、以及人的胚胎干细胞等。由于不同重组细胞系表达的重组蛋白其稳定性和糖基化类型不同，需要根据目的蛋白选择最佳的重组细胞系。 　　从上述研究成果来看，哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组细胞系中取得了积极进展，其产生的影响主要表现在两个方面：一.哺乳动物细胞系的分类越来越清晰，主要分为CHO和HEK293两大类细胞。二.哺乳动物细胞系在培养生产中种类得到了拓展，对推动哺乳动物细胞系研究具有重要作用，满足了哺乳动物细胞系研究需要。 　　3 哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组表达载体中取得的进展 　　外源基因可以通过病毒载体感染或质粒载体转染等方式进入宿主细胞。病毒载体是通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等，近几年杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达也越加受到重视。 　　质粒载体与病毒载体不同，它是借助于物理或化学的作用导入到细胞内。人工构建的哺乳动物细胞质粒表达载体一般为穿梭载体。含有原核基因序列，便于载体在原核细胞中扩增和大量制备，另外含有能使外源基因在哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子元件，以及终止子和加polyA信号序列等。Invitrogen公司的pcDNA系列载体是实验中常用的哺乳动物细胞表达载体。 　　外源基因能否在宿主细胞中获得高效表达主要取决于表达载体上启动子和增强子的强弱、二者之间的搭配、以及它们与宿主细胞类型的兼容性。目前常用表达载体的启动子包括人巨细胞病毒早期启动子（CMV-IE）、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉瘤长末端重复序列。近年来新发现的强启动子如人编在蛋白（ubiquitin）C基因启动子以及一些新构建的杂合启动子不仅具有更高的活性，而且具有更广阔的宿主细胞范围。 　　上述研究表明，不断地筛选改造载体上的表达结构元件是优化表达载体、提高蛋白质药物在哺乳动物细胞中表达量的不变的方向。 　　4 哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在生物制备过程中取得的进展 　　哺乳动物细胞大规模培养的工业化生产过程绝大多数是在生物反应器中进行的单细胞悬浮式培养，反应罐的体积可达20吨。为了节约成本，减少动物血清对产品的污染，现在主要采用无血清培养基，目前有多家商业公司提供适用不同细胞株和不同生产工艺的无血清培养基，如UltraCulture，ProCHO，Pro293等。 　　考虑到制药过程的现实需要，提高生物制备能力