蛇床子素(osthole)对肝细胞肝癌的抑制作用及其机制研究-免疫学专业论文.docxVIP

中文摘要第一章 蛇床子素抗肝细胞肝癌作用的研究目的：研究蛇床子素抗肝癌作用及其特点。方法：采用 MTT 方法和流式细胞 术 观 察 蛇 床 子 素 对 体 外 培 养 肝 癌 细 胞 株 增 殖 、 凋 亡 和 周 期 的 影 响 ； 应 用 SMMC-7721 裸鼠肝癌模型和 Hepa1-6 C57 小鼠肝癌模型观察蛇床子素在体的抗肝 癌效应和毒性，及其在肝癌小鼠体内的吸收和分布研究。结果：1）蛇床子素对人 肝癌细胞 SK-HEP-1、SMMC-7721 和 HepG-2，小鼠肝癌细胞 Hepa1-6 的增殖均有 抑制作用，且有剂量和时间依赖关系；也可抑制正常肝细胞的增殖，但其 IC50 高 于四株肝癌细胞，表现为其细胞毒性是有选择性的。2）蛇床子素可诱导人肝癌细 胞 SMMC-7721 和小鼠肝癌细胞 Hepa1-6 的凋亡，对周期进程阻滞在 G2 期。3） 蛇床子素可抑制裸鼠和 C57 小鼠肝癌模型的肿瘤生长，腹腔注射给药方式优于口 服灌胃。4）蛇床子素可以进入肝癌小鼠血流较丰富的组织（包括肿瘤），其转运 机制主要为简单的被动扩散。结论：蛇床子素是一种低毒、具有抗肝癌效应的天 然化合物。第二章 蛇床子素诱导肝细胞肝癌凋亡机制的研究目的：阐明蛇床子素诱导肝癌细胞凋亡的机制。方法：应用 Real-time PCR 方 法观察蛇床子素对凋亡相关 84 个基因表达的影响；采用 western blot 和 EMSA 技 术观察蛇床子素对 Bax、Bcl-2、Caspase、PARP、CyclinB、NF-κB 蛋白水平以及 PI3K/Akt 通路调节的影响；并采用 MTT 法观察蛇床子素与 Trail 联合用药对 SMMC-7721 肝癌细胞增殖的影响。结果：1）蛇床子素可以使 28 个凋亡相关因子 表达升高，其中 TNF 受体（占 21.43% ）和 TNF 配体（占 17.86% ）家族所占比 例最高。2）蛇床子素可以上调肝癌细胞中 Bax 蛋白的表达，下调 Bcl-2 蛋白的表 达，使 Bax/Bcl-2 的比值增高；促进 Caspase-3、Caspase-8 和 Caspase-9 的活化，PARP 蛋白酶的剪切；下调周期蛋白 Cyclin B1 的表达。3）蛇床子素可抑制肝癌细胞中 NF-κB 的活化，有时间和剂量依赖性。4）蛇床子素对肝癌细胞中总 Akt 表达无影中文摘要 蛇床子素（osthole）对肝细胞肝癌的抑制作用及其机制研究 响，可下调磷酸化 Akt 和 PI3K 二个亚基（p110 和 p85）蛋白的表达。胰岛素可以 减弱蛇床子素对磷酸化 Akt 和 PI3K p110 亚基蛋白表达的下调，而 LY294002 可增 强其下调作用。5）蛇床子素可增强 TRAIL 对 SMMC-7721 肝癌细胞增殖的抑制， 但随着蛇床子素浓度的增加，其增强作用逐渐减弱。结论：蛇床子素诱导凋亡的 机制是多靶点和多通路；可能作用于与 TRAIL 相同的靶点，其机制为通过抑制 PI3K/Akt 通路的激活，从而抑制 NF-κB 的活化，下调周期蛋白 CyclinB，阻滞细胞在 G2/M 期；同时可以上调 Bax 蛋白表达，激活 Caspase-9；并通过死亡结构受 体激活 Caspase-8，继而激活 Caspase-3，促进 PARP 的剪切，从而诱导肝癌细胞凋 亡。第三章 蛇床子素对抗肿瘤免疫功能的增强效应目的：研究蛇床子素对肝癌小鼠免疫系统的影响，进一步从免疫增强角度探 讨蛇床子素抗肝癌的作用机制。方法：采用 MTT 法观察蛇床子素对体外培养脾淋 巴细胞增殖的影响；应用 Hepa1-6 C57 小鼠肝癌模型，采用流式细胞术测定小鼠脾 脏中各淋巴细胞亚群和 ELISA 法测定血清中 IL-2、TNF-α 水平，观察蛇床子素对 小鼠抗肝癌免疫反应的影响。结果：1）低浓度的蛇床子素可以促进未刺激和 ConA、 LPS 刺激下小鼠脾淋巴细胞的增殖。2）蛇床子素对肝癌小鼠的胸腺重量和胸腺指 数无影响，对脾脏重量和脾脏指数有增高趋势。3）蛇床子素对肝癌小鼠脾脏中 B 细胞的比例和数量，及其活化和成熟均无影响；有升高巨噬细胞、CD4+T 和 CD8+T 细胞的比例和数量的趋势，对 CD4+/CD8+比值保持在正常水平，并可提高肿瘤组 织中 CD4+T 和 CD8+T 细胞的比例。4）蛇床子素可以促进肝癌小鼠脾脏中 CD4+T 和 CD8+T 细胞的活化，提高 CD8+效应型 T 细胞的比例。5）蛇床子素可降低肝癌 小鼠脾脏中 CD4+CD25+Foxp3+调节性 T 细胞的比例。6）蛇床子素可以增高肝癌小 鼠血清中 IL-2 和 TNF-α 水平。结论：蛇床子素具有增强肝癌小鼠抗肿瘤免疫反应 的作用关键词：蛇床子素；肝细胞肝癌；抗肿