胞内钙及小g蛋白对人中性粒细胞胞吐的调控作用分析-analysis of the regulatory effects of intracellular calcium and small g protein on human neutrophil exocytosis.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文I__#==========；=％==∞==≮{=；==；=；一=摘要细胞分泌是细胞发挥生物学功能的重要途径，分泌的分子机制的研究在近些年取得了长足的进展。ca2+由于在膜融合步骤中的显著作用而受到重视，被认为是刺激-分泌路径的偶联因子；小G蛋白也由于对细胞骨架蛋白的影响而在分泌中发挥调节作用，这种作用在非兴奋性细胞中尤为显著。中性粒细胞作为一种重要的免疫细胞，参与一些炎症反应，在机体抵抗细菌感染中发挥重要作用。近年来又有证据表明，中性粒细胞可能也参与了慢性哮喘等I型超敏反应。因含有较多的颗粒，中性粒细胞成为继肥大细胞之后另一种细胞分泌研究的模型。为了更好地了解胞内ca-+及小G蛋白对中性粒细胞各种颗粒分泌的调节作用，本文以正常成人外周血中性粒细胞为研究对象，采用全细胞膜片钳模式、胞内灌流、荧光测钙及光解释放技术，以及膜电容检测技术等方法，研究了胞内Ca2+及OTP．rS促进颗粒释放的动态特性。?研究工作取得的主要结果如下：k1．微电极灌流提高胞内[Ca-]的实验结果显示，Ca2+刺激未经细胞松弛素作用过的中性粒细胞的分泌也可分为两相，分泌量可完好地对应于不同颗粒群的释放。第一相分泌对Ca+的EC50值约为1．1lamol／L，膜电容增加的平台幅度值为1．21pF，可较好地对应于分泌囊泡和三级颗粒的释放；第二相对ca2+的EC50值则约为32．4“mol／L，远低于经细胞松弛素作用后的细胞(100gmol／L)。同时，Ca2+可剂量性的增加中性粒细胞的分泌总量、分泌平均速率以及囊泡的融合速率，暗示颗粒最终的融合步骤并不是分泌主要的限速步骤，而ca2+的影响应该主要在于促使一、二级颗粒移动，进而转运至质膜发生分泌。2．首次在中性粒细胞上应用光解释放技术提高胞内【ca2卞】触发分泌，实验中发现，闪光光解快速提高钙浓度后可见一极小而快速的分泌相，大小约为40伍，其f值约为130ms，区别于紧随其后的、大小约有300行、t值约在9．3s左右的慢相分泌；缓慢光解的实验中只见到慢相分泌，大小及T值与flash实验的接近。由于Ca-+作用时间短暂，这一相可能与微电极灌流实验中得到的第一相属于同种颗粒华中科技大学硕士学位论文的分泌。分泌量最大的一相只有当用高浓度的Ca2+(EC5032．4I．tmol／L)持续作用时才会出现。这三种成分的分泌有可能对应于不同的囊泡和颗粒的释放，说明中性粒细胞已锚定的和靠近质膜的囊泡只占极少数，而大部分颗粒的释放需要Ca-‘的持续活化，暗示颗粒转运步骤需要Ca2+的参与。3．胞内应用Gn’S可触发中性粒细胞显著的分泌，且最终分泌量与GTPTS的浓度没有明显的依赖性。20～100tamol／L的GTP-tS都可以触发细胞分泌量达5pF以上，表明胞内小G蛋白的活化程度不影响细胞的最终释放量；而GTPrS影响了细胞分泌的平均速率，随G1聊s浓度的增加，平均速率增大。暗示细胞骨架蛋白在颗粒的转运中起到重要作用。．关键词：中性粒细胞膜片钳膜电容检测显微荧光测钙—～———_—一一‘。～一一“一光解释放’～～一钙小G蛋白分泌调控————————————————————————————一Ⅱ=；===；$_=％===≈====；；======；==々=华中科技大学硕士学位论文ABSTRACTRegulatedexocytosisisinvolvedinavarietyofphysiologicalfunctions，andgreatprogresshasbeenmadeinitsmolecularmechanismresearchinrecentyears．Calciumisregardedasaimportantfactorinstimulus-secretioncoupling，andfunctioninthefusionbetweentheplasmamembraneandvesiclemembrane；SmallGTP—bindingproteinsalethekeyactivatorsincellsofhaematopoieticorigin，regulatetheexocytosisthroughtheinteractionwithcytoskeleton-relatedproteins．Neutrophilisoneofimmunesystemcellsimportantforhostdefenseagainstmicrobialinfection，andtherearecluesindicatedthatneutrophilsmayalsohaveeffectsonthepathophysiologyoftheairwayobstructioninchronicasthma．Thedeta