肠道病毒71型基因组分析和sars冠状病毒结构蛋白的鉴定与分析-genome analysis of enterovirus 71 and identification and analysis of sars coronavirus structural protein.docx

中文摘要本文对肠道病毒71型(SHZH03毒株)进行了全基因组序列测定，利用巴斯德 毕赤酵母系统表达了肠道病毒71型外壳蛋白vP2，对SAILS冠状病毒的核蛋白(N) 和突起子糖蛋白(s)进行了鉴定与分析，研究结果如下： 1．肠道病毒71型(SHZH03毒株)全基因组序列测定对肠道病毒71型(eaterovirus 71，EV71)国(深圳)分离株SHZH03基因组建立 了覆盖全基因组的8个首尾重叠的克隆，并在此基础上对全基因组昧包括多聚腺苷 酸尾)的7406个碱基进行了核苷酸序列的测定和分析。结果表明，SHZH03株基因组具有典型的肠道病毒71型的基因组结构，在编码区没有核苷酸的缺失和插入；在 5UTR和3UTR区，SHZH03在核苷酸序列和长度上和其它EV71有差异，存在缺失 和插入。核苷酸同源性比较结果表明，在P1区，SHZH03株与台湾流行株(TW2086、 TW2272)的同源性较高，为87．9～92．5％；与新加坡流行株SIN5666、SIN5865以及 标准株MS和BtCr的同源性则为80．4～82．3％，而与CoxsaldevirusAl6的同源性最 低，为63+6％。氨基酸同源性比较结果表明，在P1区SHZH03株与Coxsakievirus A16 的同源性最低(79．8％)，但在p2和P3区，SHZH03株与CoxsakievirusAl6的同源 性最高(98．3％和96．8％)。P1区的遗传进化分析表明，SHZH03株和台湾98年流行 的EV71毒株的亲缘关系较近，而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远。外壳蛋白 基因vPl的遗传进化分析表明，SHZH03和SHZH98以及台湾1998年Ev71流行时 的8个毒株属于同一组(dusted。这些结果提示了我国深圳地区流行的肠道病毒 71型有可能来源于台湾1998年的Ev71大规模流行时的毒株，对于我国EV71的基 因分型、分子流行病学研究、EV71流行规律和疾病的治疗与预防都有借鉴意义。2．肠道病毒7l型外壳蛋白VP2在巴斯德毕赤酵母中的表达 从细胞培养物中提取EV71病毒基因组RNA，再利用RT—PCR技术，扩增出EV71外壳蛋白基因VP2，连接于T载体，经测序证实目的基因VP2的序列正确：构建酵 母分泌型表达质粒peIC9KfVP2，经序列测定证实a—factor信号肽和VP2的序列和 阅读框正确后，经SacI酶切使之线性化，用电转化法将目的基因转化并整合到宿主 菌GSl 15基因组中；经G418加压筛选多拷贝整合菌株、转化子表型筛选和PCR分 析鉴定后以及甲醇诱导，在Pichiapastoris酵母中实现了VP2的高效分泌性表达。 经饱和硫酸胺分级沉淀法初步纯化后，重组蛋白VP2的纯度可达90％以上。 SDS．PAGE分析表明，表达产物的分子量为27kD，与天然VP2大小相近。Western blot 分析和ELISA实验表明，Pichiapastoris酵母表达的重组蛋白VP2具有免疫学活性， 为研发快速、灵敏的诊断试剂和安全、高效的基因工程亚单位疫苗打下了良好的基‘●石出。3．SARS冠状病毒的核蛋白(N)和突起子糖蛋白(s)的鉴定与分析 从广东分离了确诊为非典型肺炎死亡病例的尸解标本，利用293细胞系进行扩增，待细胞出现典型的CPE后，收集细胞并分离病毒，利用蔗糖密度梯度超速离一11, 方法纯化病毒颗粒。经SDS电泳分离，银染或考马斯亮蓝染色，在凝胶上 出现大量非常明显的条带。将所有的侯选条带从凝胶中切下，Trypsin降解，质谱(LCQDECA x一“ProteomeX Workstation)分析，证实47KD左右条带为SARS—CoV病毒颗粒的核(N)蛋白带；150KDa附近条带为SARS—CoV病毒颗粒的s糖蛋白带。所 获得的SARS冠状病毒核蛋白的质谱分析数据覆盖了所预测病毒核蛋白氨基酸序列 的98％(第一次质谱分析数据的覆盖率为87％，第二次质谱分析数据的覆盖率为 76％)。从而首次从蛋白质水平对SARS冠状病毒核蛋白进行了证实。所获得的S蛋 白氨基酸序列的质谱分析数据占所预测S蛋白氨基酸序列的百分比较低，仅为47％， 但在我们获得的一系列二级质谱碎片的氨基酸序列与SARS—CoV基因组所预测s蛋 白质的序列完全吻合，从而在蛋白质水平对SARS冠状病毒的s蛋白及其序列进行 了证实。我们在分析S蛋白质谱数据时，发现了一些SARS冠状病毒膜蛋白(M)的 氨基酸序列，提示SARS冠状病毒存在S蛋白和M蛋白的相互作用。关键词：肠道病毒7l型核苷酸序列分析VP2Pichia pastorisSARS冠状病毒蛋白质组学2ABSTRACTThe present work aimed at the complete genome sequen