百合无症病毒tgb基因克隆 表达及定位分析-cloning, expression and localization analysis of tgb gene in lily symptomless virus.docx

研究生优秀毕业论文大连理工大学硕士学位论文摘要自发现植物病毒的运动蛋白以来，对不同种类运动蛋白的结构、功能的研究已经比较深入，但是对于百合无症病毒(LilysymptomlessvirusSV)运动蛋白的研究还处于初级阶段。本研究通过引物扩增获得LSV的运动蛋白基因；对基因序列进行比对，构建进化树，利用生物信息学软件对基因进行分析；构建原核表达载体，诱导表达TGBpl；利用绿色荧光蛋白融合技术，对运动蛋白进行定位分析。研究结果对了解LSV运动蛋白的结构和功能，以及在病毒侵染过程中的作用机制具有重要的理论参考价值。设计引物，以感病百合“西伯利亚”叶片总RNA为模板，扩增获得LSV的运动蛋白基因，运动蛋白基因全长1161bp，含有三个重叠基因(TGBl、TGB2、TGB3)，称为三基因连锁结构(Triplegeneblocks，TGB)。生物信息学分析显示，基因编码三段运动蛋白TGBpl(228aa)、TGBp2(106aa)、TGBp3(64aa)：进化树分析显示LSV．TGB1与百合潜隐病毒和伽蓝菜属潜隐病毒的TGBl相似度较高，LSV_TGB2与百合潜隐病毒相似度较高，LSV．TGB3与紫茉莉斑点病毒相似度较高，TGBl的保守性最高，TGB3的保守性最差；TGBp3为疏水性蛋白；TGBpl为多功能蛋白，具有RNA解旋酶和核酸水解酶活性，氨基酸序列中含有ATP结合区和核酸结合区，在病毒运动中起主导作用；TGBp2保守性较高，与马铃薯病毒X(PVX)类病毒的TGBp2相似度高，并且TGBp2、TGBp3都为结构性蛋白，结合到内质网上，在病毒运动中起到辅助作用；TGBpl无跨膜结构域，TGBp2、TGBp3分别有两段、一段跨膜结构域；三段蛋白都没有卷曲螺旋结构；构建三段蛋白的三维结构模型。将TGBl基因连接表达载体PET-28a(+)，转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，诱导TGBpl的表达，SDS．PAGE以及Western-Blot验证带有His标签的TGBpl成功表达，对表达产物进行质谱分析，获得质谱结果。利用亲和层析的原理，根据包涵体纯化的方法，成功纯化得到纯度较好的TGBpl。利用绿色荧光蛋白融合技术，将三段TGB基因连接eGFP，插入到双元表达载体pTFl01．1．35S上，转入农杆菌GV3101感受态细胞中，侵染洋葱表皮细胞，用共聚焦显微镜观察三段蛋白在洋葱细胞上定位情况，发现，TGBpl．GFP主要定位在细胞壁或呈点状嵌入细胞壁，少量位于胞质内部；TGBp2与TGBp3主要位于细胞内。关键词：百合无症病毒(LSV)；运动蛋白；三基因连锁结构(TriPlegeneblocks，TGB)；蛋白表达；亚细胞定位万方数据百合无症病毒TGB基因克隆、表达及定位分析Cloning，ExpressionandLocationforTGBgeneofLilysymptomlessvirusAbstractSincescientistsfoundthemovementprotein(M[P1ofphmvirus．thestructureandfunctionofthedifferenttypesofMPhavebeencomparativelyconductedthethoroughresearch,butthereWaSveryfewresearchaboutmovementproteinofLilysymptomlessvirus．ThesequencesofMPofLSVwasclonedandprovidedacomparisonwithothergenes．T11eevolutionarytreeswerebuilt，usingsoftwareofbioinformaticstoanalyzegene．TheconstructedexpressionvectorsweretransformedintoE．coliBL21thatwasinducedbyIPTGforexpressingtheproteinsofTGBpl．Themovememproteinlocalizationwasanalysedbygreenfluorescentproteinfusiontechnology．∞HiSstudyresultwasofimportantvaluetOunderstandthestructureandfunctionofmovementprotein,andintheprocessofvirusiIlfectionmechanism．TheprimersofMPofLSVweredesignedtoamplifiedthetargetgene．ThegeneOfⅣ口was1161bp，containingthre