高直链淀粉玉米种质的类群分析及sbei、sbeiib基因分子标记的开发-group analysis of high amylose maize germplasm and development of molecular markers of sbei and sbe iib genes.docxVIP

摘要玉米(zea mays L.)是世界上大范围种植的一种作物，玉米淀粉有广泛用途，所含 的直链淀粉在工业上应用很广。普通玉米的直链淀粉所占比重较低，从普通玉米籽粒 中分离直链淀粉成本很高，这限制了直链淀粉的应用。因此，开展高直链淀粉玉米育 种，对发展高直链淀粉的生产和加工具有重要意义。国内高直链淀粉玉米资源严重匮 乏，从国外引进高直链淀粉玉米种质能有效拓宽高直链淀粉玉米种质资源。控制直链 淀粉含量的主效基因为 ae 基因，同时还有许多修饰基因共同起作用。本文根据发表 在 NCBI 上公布序列克隆高直链淀粉玉米的 ae 与 sbeI 基因，开发相应分子标记，最 终用于高直链淀粉玉米分子标记辅助育种。结果表明：1. 用 25 对 SSR 分子标记扩增 16 份高直链淀粉玉米自交系和 2 份普通玉米基因 组，共检测出 65 个等位基因，18 份材料的遗传相似系数(0.446~0.923)。利用 UPG MA 方法聚类分析，将 16 份高直链淀粉玉米自交系划分为两类，有 4 份材料划分到 SS 种质群中，另外 12 份划分到 NSS 种质群中。其中非常宝贵的 GMES-0067，是目 前唯一公开的直链淀粉含量高达 70%以上的种质，这一种质被划分到 NSS 种质群。 通过对高淀粉玉米自交系的遗传多样性分析，研究供试自交系的杂种优势类群，为高 直链淀粉玉米育种和种质改良提供依据。2. 根据 NCBI 上公布的 ae 基因序列(AF072725)设计引物，分别克隆 GEMS-0067、LH324、BC300、I115 以及昌 7-2 的 ae 基因 cDNA。序列比对分析表明，高直 链淀粉玉米和普通玉米的 cDNA 序列具有较高同源性，但是所测高直链淀粉玉米的 ae 基因的第 9 个外显子序列全部缺失，而且高直链淀粉玉米与普通玉米的 ae 基因 cDNA 序列还存在几个不同碱基的差异。3. 将上述第 9 外显子差异处设计引物，在基因第 8 和第 10 外显子各选一段序列 作为标记引物。在含有 ae 基因的玉米材料中能够扩增出一条 750bp 的特异性条带， 而在普通玉米中扩增出一条 1576bp 的特异性条带，称之为 ae-InDel 标记。利用该标 记对 16 种高直链淀粉玉米自交系和 10 种普通玉米自交系材料进行检测，高直链淀粉 玉米自交系基因组中均能扩增出 750bp 条带，在普通玉米自交系中扩增出 1576bp 条 带，在高直链淀粉玉米与普通玉米的 F1 代中，能扩增出 750bp 和 1576bp 的条带。因 此该标记可作为 ae 基因的共显性功能标记。4. 根据 NCBI 上公布的 sbeI 基因的序列(NM_001111900)设计引物，分别克隆 16个高直链淀粉玉米基因的 sbeI 的 cDNA，序列比对分析表明，高直链淀粉玉米与数据 库中 sbeI 的 cDNA 序列具有很高的同源性，但是所测 GMES-0067 的 sbeI 基因有 15 个碱基的改变，其中 5 个碱基改变导致该位点氨基酸发生突变，而其它高直链淀粉玉 米 sbeI 与网上公布 sbeI 序列预测的蛋白序列没有差异。5. 将 GMES-0067 的 sbeI 基因其中一个改变相应位点氨基酸的碱基 1330 (C-A)开 发成功能标记，利用该引物扩增高直链淀粉玉米与普通玉米的基因组，均扩增出一条 906bp 的特异条带，但是用 AluI 酶切处理后，只有 GMES-0067 的条带大小没有变 化，而其他材料均被切割成两个小片段(617bp 和 289bp)。用该方法检测 F1(GMES- 0067x 昌 7-2)有三条带，因此该标记可作为 GMES-0067 的 sbeI 等位基因的共显性分 子标记。关键词：玉米，高直链淀粉，聚类分析，分子标记辅助育种Abstract:Maize (zea mays L.) is a widely planted crop in the world. As a raw material, maize amylose is on a more wide range of uses in industrial. But in the conventional maize, low amylose content and high costs of amylose extracting and separating from kernel limits amylose application. Therefore high amylose maize breeding is very important. ae is the major amylose content controling gene. Meanwhile t