慢性乙型肝炎患者hbv逆转录酶区新变异rta181c的鉴定及表型耐药特点的研究-identification of new mutation rt a181c in hbv reverse transcriptase region and study on the characteristics of phenotypic drug resistance in patients with chronic hepatitis b..docxVIP

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2018-07-27 发布于上海
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慢性乙型肝炎患者hbv逆转录酶区新变异rta181c的鉴定及表型耐药特点的研究-identification of new mutation rt a181c in hbv reverse transcriptase region and study on the characteristics of phenotypic drug resistance in patients with chronic hepatitis b..docx

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慢性乙型肝炎患者hbv逆转录酶区新变异rta181c的鉴定及表型耐药特点的研究-identification of new mutation rt a181c in hbv reverse transcriptase region and study on the characteristics of phenotypic drug resistance in patients with chronic hepatitis b.

慢性乙型肝炎患者HBV逆转录酶区新变异rtA181C的鉴定及表型耐药特点的分析研究生：刘佳慧导专师：胡景鑫徐东平业：病理学与病理生理学中文摘要背景：乙型肝炎病毒（HBV）是危害人民健康的重要疾病。目前，核苷（酸）类似物（NA）是有效控制慢性乙型肝炎病情进展的主要临床用药，但长期用药容易导致药物作用靶位HBV逆转录酶（RT）区产生耐药变异，极大地限制了其抗病毒疗效。目前研究发现与核苷（酸）类似物耐药相关的变异位点包括拉米夫定为M204V／I、L180M、V173L、A181T、v207I；阿德福韦为N236T、A181V／T；恩替卡韦为M250V+I169T+M204V+L180M、T184G+S202I+M204V+L180M。除了常见的NA耐药变异形式，RT区产生的新变异也值得我们关注。目的：本研究对一例NA序贯治疗的慢乙肝患者血清HBV逆转录酶（RT）区产生的新变异rtA181C进行鉴定并分析其表型特点，为临床合理制定抗HBV治疗方案提供依据。材料与方法：本研究的血清样本取自2010年6月解放军第302医院确诊的慢性乙型肝炎患者，男43岁，排除其他因素所致肝功能损害。HBV血清学检测显示：HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性。提取患者血清中HBVDNA，巢式PCR扩增HBVRT全基因，PCR产物直接双向测序结合克隆测序分析HBVRT区12个耐药相关突变位点。构建代表性克隆重组表达载体pTriEx-HBV1.1，提纯质粒瞬时转染人肝癌细胞系HepG2细胞，转染4h后加入不同浓度拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替诺福韦，转染96h后采用实时荧光定量PCR检测不同药物浓度作用下培养细胞上清中HBVDNA复制水平并分析其表型耐药特点。结果：此例慢乙肝患者序贯接受拉米夫定治疗36个月→阿德福韦治疗14个月→恩替卡韦治疗29个月，而后发生病毒突破，HBVDNA由阴性升高到1.1×106IU/mL，转氨酶由正常升高到235U/L。直接测序显示HBVRT基因rtL180M+rtA181V+rtM204V变异，克隆测序得到18个克隆，其中9个为rtL180M+rtA181V+rtM204V变异株，1个为rtV173L+rtL180M+rtA181V变异株，7个为rtL180M+rtA181C+rtM204V变异株，1个为野生株。病毒复制力检测结果从高到低依次为：野生株rtV173L+rtL180M+A181VrtL180M+rtA181C+rtM204VrtL180M+rtA181V+rtM204V。表型耐药分析显示：与野生株比较，rtL180M+rtA181V+rtM204V变异株和rtV173L+rtL180M+rtA181V变异株对拉米夫定和阿德福韦不敏感，rtL180M+rtA181C+rtM204V变异株对拉米夫定和恩替卡韦不敏感。结论：长期核苷（酸）类似物（NA）序贯治疗可引起多重耐药发生；rt181位点新的变异rtA181C与恩替卡韦长期用药相关，可能是新的恩替卡韦耐药位点。关键词：乙型肝炎病毒；核苷（酸）类似物；逆转录酶；基因变异；表型耐药IdentificationandphenotypicanalysisofanovelmutationrtA181CinHBVreversetranscriptaseregionofapatientwithchronichepatitisBPostgraduate:LIUjia-huiTutor:HUjing-xinXUdonMajor:PathologyandpathophysiologyAbstractBackground：HepatitisBisanimportantdiseasewithgreatmenacetopeople’shealth.Currently,thenucleos(t)ideanalogue(NA)isthemainclinicalmedicinecontrollingoftheprogressionofchronichepatitisBeffectively,butlong-termnucleot(s)ideanaloguesequentialtreatmentcouldleadtoHBVreversetranscriptase(RT)regionresistancemutation,limitingitsantiviralefficacygreatly.Thecurrentstudyfoundthatwiththenucleos(t)ideanalogue(NA)resistance-associatedmutationsites,includinglamivudinefortheM204V/I,L180M,V173L,A181T,v207I;adefovi