氢盐水治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的效应和机制分析-effect and mechanism analysis of hydrogen saline on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.docxVIP

摘要卒中在全世界范围内具有“三高”的特征，高致死率、高发病率、高致残率。据联合国统计调查57个国家，卒中在40个国家致死致残疾病中排列到前三位。而我国国家卫生部2008年6月公布统计数字脑血管疾病和癌症并列我国居民疾病死亡率第一位。卒中分为缺血性卒中和出血性卒中，缺血性卒中占卒中发病率的多数。缺血性卒中具有发病相对较缓，但愈后较差，给社会和家庭造成了沉重的压力。但直到现今为止，治疗缺血性卒中行之有效的药物却很少。临床上采用最直接的办法及时恢复血流，但也同样会引发随后的病症损伤脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤是指缺血脑组织恢复血流灌注后，引发的对脑组织损伤进一步加重的现象。近年来对其发生机制进行研究，可能的原因包括自由基损伤、白细胞聚集、炎症因子损伤、细胞凋亡及相关基因等等。在2007年日本科学家IkurohOhsawa在《NatureMedicine》上发表一篇名为《Hydrogenactsasatherapeuticantioxidantbyselectivelyreducingcytotoxicoxygenradicals》的文章，首次提出让大鼠呼吸浓度2%氢气的方法，可以选择性的清除自由基。氢是自然界最简单的元素，氢气是无色、无味、具有一定还原性的双原子气体，而且价格便宜。呼吸一定浓度的氢可治疗脑缺血再灌注损伤，但是，通过呼吸的方法不仅在气体混合过程中存在爆炸的危险，而且需要特殊的设备，操作比较复杂，在临床上难以推广。因此,寻找更加实用的给药方法也是需要探讨的问题。本课题组经过理论推算，发现如果将纯氢在生理盐水中溶解，经过一定的处理，使其达到饱和溶解，可制造出氢的生理盐水饱和溶液（已申请国家专利），经气相色谱仪器测量，氢盐水中含有氢气的浓度为1.8%，这样就可通过注射氢溶液的方法给药。目前我们已经制备出这种溶液，采用腹腔或静脉注射饱和氢盐水，证明该注射液对新生儿脑缺血缺氧损伤后行为学、脑梗死体积和组织损伤程度均有明显改善作用，特别是我们发现，早期治疗可明显改善新生儿脑缺血缺氧损伤２个月后神经功能和学习记忆能力。进一步研究还发现，该注射液对小肠缺血再灌注损伤、小肠缺血再灌注后引起的肺损伤、心肌、肝和肾均具有治疗作用,并都已发表相关文献。因此，注射含氢生理盐水是一种简便且有效的给药途径。本课题采用的实验动物是Sprague-Dawley(SD)大鼠，250-280g,动物手术方法参照Zea-Longa线栓法加以改良。治疗药物采用我们制备出的氢盐水，剂量为1ml/100g。因为大鼠与人脑血管结构相似，能很好的模拟人脑缺血再灌的过程。我们通过形态学、症状学、病理学等不同指标分别评价氢盐水对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗保护机制。本实验从两方面探讨氢盐水的治疗机制：（1）在大鼠缺血再灌注后不同时间点注射氢盐水并在不同时间点处死大鼠观察自由基造成的氧化损伤变化。（2）在大鼠缺血再灌注后不同时间点注射氢盐水并在不同时间点处死大鼠观察测定线粒体途径的凋亡酶活性及凋亡蛋白和炎症因子的变化。旨在为氢盐水以后应用在临床提供实验依据。第一部分氢盐水对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护效应目的：证明给大鼠注射氢盐水对其缺血再灌注具有神经保护作用，同时观察缺血再灌注后不同时间点给药和不同时期缺血皮层的变化程度。方法：动物随机分为3组：动物随机分为3组：假手术组；MCAO+氢盐水治疗组；MCAO+生理盐水注射组。根据改良的Zea-Longa线栓法制作MCAO再灌注损伤模型。氢盐水在缺血再灌注损伤后不同时间点按1ml/100g腹腔注射，对照组（MCAO+生理盐水注射组）注射同样剂量的生理盐水，假手术组仅进行手术操作过程而不造成缺血。氢盐水治疗组和对照组根据临床缺血治疗时间窗再分为再灌注后0小时、3小时、6小时三个亚组。再灌注后12小时、24小时、72小时和7d取材。造模后观察各组动物的一般精神行为状态，体重变化，根据Atochin的神经学评分方法对神经功能缺损症状评估，测定脑组织含水量，TTC染色，并对脑组织进行灌流切片，行NISSL染色，在镜下对神经细胞进行计数并进行8-HOdG和MDA的测量。结果：在缺血再灌注0h后，MCAO+生理盐水注射组脑组织梗死的体积是23.86%±3.62；MCAO+氢盐水注射组脑组织的梗死体积是7.27%±3.57；在缺血再灌注3h后，MCAO+氢盐水治疗组脑组织梗死的体积是10.82%±3.06；在缺血在灌注后6h后，MCAO+氢盐水治疗组脑梗死的体积是16.22%±2.25。使用氢盐水治疗与MCAO+生理盐水注射组比较明显减少梗死形成和脑组织梗死体积（P0.01）。MCAO+生理盐水组的脑水肿明显重于假手术组（P0.01）和氢盐水治疗组（P0.01）。MCAO+3h后氢盐水治疗组与MCAO+3h后生理盐水注射组体重减轻有