水禽呼肠孤病毒感染番鸭肝脏的差异蛋白质组学分析-differential proteomic analysis of muscovy duck liver infected with waterfowl reovirus.docxVIP

1.4.1肝脏蛋白样品的制备241.5双向电泳261.5.1第一向等电聚焦（IEF）261.5.2第二向SDS电泳281.5.3凝胶染色291.5.42-D图象312结果与分析312.1动物实验312.2蛋白质含量332.3番鸭肝脏蛋白质提取方法的优化342.4双向聚焦程序的优化36第四章感染番鸭呼肠孤病毒的肝脏蛋白质组学研究381实验材料与方法382双向电泳382.1第一向等电聚焦（IEF）382.1.1主动水化上样382.1.2IPG胶条的平衡382.2第二向SDS电泳382.2.1配制12%的丙烯酰胺均一凝胶382.2.2垂直SDS.3凝胶染色392.42-D图象分析392.5胶点蛋白鉴定392.5.1蛋白质胶内酶解392.5.2MALDI-TOF/TOF上机392.5.3信息分析流程402.5.4生物信息分析402.6蛋白免疫印迹实验（Westernblotting）412.6.1制备SDS凝胶412.6.2电泳412.6.3转膜412.6.4免疫反应413结果与分析423.1EttanIPGphorⅢ控制软件423.22-D图像423.3胶点蛋白鉴定结果与分析443.3.1样品鉴定443.3.2MDRV组与正常组的差异蛋白点443.3.3差异表达蛋白的亚细胞定位和功能分类493.4蛋白免疫印迹结果与分析504MDRV组的差异蛋白点的分析51第五章感染新型鸭呼肠孤病毒的肝脏蛋白质组学研究541实验材料与方法54II2双向电泳542.6.2电泳562.6.3转膜562.6.4免疫反应563结果与分析563.1EttanIPGphorⅢ控制软件563.2三组样品的2-D图像573.3胶点蛋白鉴定结果与分析583.3.1样品鉴定583.3.3差异表达蛋白的亚细胞定位和功能分类623.4蛋白免疫印迹结果与分析644NDRV组的差异蛋白点的分析64第六章结论66参考文献68附录：主要实验试剂配制70摘要水禽呼肠孤病毒病包括番鸭呼肠孤病毒病（俗称“番鸭肝白点病”，Muscovyduckreovirusis，MDR）和新型鸭呼肠孤病毒病（俗称‖鸭出血坏死性肝炎‖，Novelduckreovirusis，NDR）均是近年我国新出现的危害养鸭业的重要疫病，但这两者的致病性差异较大，致病差异机理不明。本研究首次应用差异蛋白质组学分别研究MDRV和NDRV感染雏番鸭的肝脏蛋白质组差异，为深入研究两种病毒之间的致病机理奠定良好理论基础。1番鸭人工感染实验4日龄健康番鸭随机分成MDRV感染组、NDRV感染组和正常对照组，同等条件下隔离饲养。其中MDRV感染组腿肌接种0.2mLMDRV细胞毒；NDRV感染组腿肌接种0.2mLNDRV细胞毒；正常对照组腿肌接种0.2mLHank’s液。分别采集接种病毒/Hank’s液1、3、4、5、6d后的肝脏并冻存于-70℃，同时观察记录肝脏的病理变化。结果发现在攻毒后第3d两组番鸭肝脏都出现轻微病变和症状，第5dMDRV组番鸭肝脏见大量白色坏死点，NDRV组番鸭肝脏见大量出血点/斑或出血灶，本研究选用攻毒后病变最典型的第5d番鸭的肝脏为样品。2番鸭肝脏二维双向凝胶电泳条件的建立和优化本研究对不同裂解液、不同上样量和相应的聚焦程序进行优化，确立了番鸭肝脏二维双向电泳凝胶技术：研磨-超声-裂解液(7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，65mMDTT，40mMTris-base，0.5%IPGbuffer)法提取肝脏蛋白质；上样时使用2Dclean-upkit以及去拖尾DeStreak试剂；上样量为1100μg；一向等电聚焦程序为：50V12h、200V1.5h、500V1h、1000V1h、8000V3h、8000V60000Vh、500V10h；采用胶体考马斯亮蓝染色方法染色。3MDRV和对照组之间的番鸭肝脏差异蛋白质通过二维双向凝胶电泳技术和PDQest8.0软件分析获取49个MDRV试验组与对照组之间的差异表达蛋白，之后运用MALDI-TOF-TOF质谱仪得到这些胶点蛋白的质量谱图，最后运用蛋白质搜索鉴定软件Mascot2.3.02鉴定蛋白，结果共鉴定出38个差异表达蛋白，包括10个表达下调的蛋白、17个表达上调的蛋白、7个仅在正常番鸭肝脏里表达的蛋白和4个仅在感染MDRV的番鸭肝脏里表达的蛋白。4NDRV和对照组之间的番鸭肝脏差异蛋白质步骤同3，获取32个NDRV试验组与对照组之间的差异表达蛋白，进一步鉴定后共有26个，包括9个表达下调的蛋白、12个表达上调的蛋白、3个仅在正常番鸭肝脏里表达的蛋白和2个仅在感染NDRV的番鸭肝脏里表达的蛋白。5MDRV和NDRV的番鸭肝脏差异蛋白点分析由于鸭的蛋白质组数据库信息不全，因此本研究运用NCBI下载的鸟纲蛋白库构建的数据库、GO数据库和PantherClassifi