生化工程综合平台实验.ppt

二 实验材料(PEG浓度) PEG 800溶液：同前 0.02 mol/L PB 7.0的配置：同前 1%的α-淀粉酶酶液：同前 40%的硫酸铵溶液：同前 带刻度的玻璃离心管4 根/小组；塑料离心管4根/小组；16 根干燥的玻璃试管； 三 实验步骤（PEG浓度的影响） 总重量为10g，硫酸铵浓度固定为20%，PEG分子量选择800 称取的PEG800，对应的PEG浓度分别为多少？ 四 实验步骤 PEG 浓度 上相 体积（mL） 上相OD280/260 下相 体积 （mL） 下相 OD280/260 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1. 上下相体积的读取：根据刻度读数直接读取 2. 上下相蛋白含量的测定：上相稀释两倍，下相不稀释，测定OD280与OD260，通过公式1.45*OD280-0.74*OD260 五 实验注意事项 实验中各组添加量总重量为10g 加完原料与蛋白后必须将离心试管沿轴向充分振摇，使固体充分溶解 上下相分离时注意吸管小心吸出上相，将多余上相和少量下相弃去，换吸管，吸出下相。 每个样品组均需设置空白对照，用于调零 六 实验数据处理分析 分子量（D） 相比 上相酶 浓度 下相酶 浓度 分配系数 400 ? ? ? ? 800 ? ? ? ? 2000 ? ? ? ? R=VT/VB -----VT为上相体积；VB为下相体积。 K=CT/CB -----CT为上相浓度；CB为下相浓度。 六 实验数据处理分析 分析分配系数是大于1还是小于1，以确定蛋白的分配选择性 分析分配系数随PEG分子量的增大，其趋势是趋向等于1还是趋向远离1，显示两相性质差异以及蛋白分配差异 分析回收率，确定蛋白质在选择性分配某相时，在该相的回收效率 六 实验数据处理分析（案例） 六 实验数据处理分析（案例） 实验三—五 硫酸铵浓度、pH值对α-淀粉酶在双水相中分配的影响 一 实验目的 硫酸铵浓度、pH值对α-淀粉酶分配行为影响的研究方法 分析比较硫酸铵浓度、pH值对α-淀粉酶分配行为的影响 二 实验原理 在PEG分子量一定的条件下，PEG浓度以及硫酸铵的浓度的改变均会改变改变两相间的性质差异，从而影响α-淀粉酶在两相间的分配。 pH值会影响蛋白质及溶液的解离状态，从而影响蛋白质在两相中的分配。 二 实验材料(硫酸铵浓度) PEG 800溶液：同前 0.02 mol/L PB 7.0的配置：同前 1%的α-淀粉酶酶液：同前 40%的硫酸铵溶液：PB 7.0溶解 带刻度的玻璃离心管4 根/小组；塑料离心管4根/小组；16 根干燥的玻璃试管； 三 实验步骤（硫酸铵浓度的影响） 对应的硫酸铵浓度分别为多少？ 固定条件：PEG-800，PEG浓度20%，pH值7.0 三 实验步骤 硫酸铵 浓度 上相 体积（mL） 上相 OD280/260 下相 体积 （mL） 下相 OD280/260 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1. 上下相体积的读取：根据刻度读数直接读取 2. 上下相蛋白含量的测定：上相稀释两倍，下相不稀释，测定OD280与OD260，通过公式1.45*OD280-0.74*OD260 二 实验材料（pH值） 0.2 mol/L pH6.4的磷酸缓冲液的配置：取2.65 mL 0.2M的Na2HPO4溶液加7.35 mL0.2M的NaH2PO4混匀，每组分25mL。 0.2 mol/L pH5.8 的磷酸缓冲液的配置：取0.8ml 0.2M的Na2HPO4溶液加9.2mL0.2M的NaH2PO4混匀。 0.2 mol/L pH8.0的磷酸缓冲液的配置：取 9.47 ml 0.2M的Na2HPO4溶液加 0.53 mL0.2M的NaH2PO4混匀，每组分25mL。 三 实验步骤（pH值的影响） 固定条件：PEG-800，PEG浓度16%，硫酸铵浓度20% 四 实验数据处理 PH值 相比 上相酶 浓度 下相酶 浓度 分配系数 5.8 ? ? ? ? 6.4 ? ? ? ? 7.0 ? ? ? ? 8.0 ? ? ? ? R=VT/VB -----VT为上相体积；VB为下相体积。 K=CT/CB -----CT为上相浓度；CB为下相浓度。 四 实验注意事项 实验中各组添加量总重量为10g 加完原料与蛋白后必须将离心试管沿轴向充分振摇，使固体充分溶解 上下相分离时注意吸管小心吸出上相，将多余上相和少量下相弃去，换吸管，吸出下相。 每个样品组均需设置空白对照，用于调零 六 实验数据处理分析 分析分配系数是大于1还是小于1，以确定蛋白的分配选择性 分析分配系数随PEG分子量的增大，其趋势是趋向等于1还是趋向远离1，显示两相性质差异以及蛋白分配