细胞程序性坏死在宿主防御病原体中的作用和调控机制分析-analysis of the role and regulatory mechanism of programmed cell necrosis in host defense against pathogens.docxVIP

细胞程序性坏死在宿主防御病原体中的作用和调控机制研究中文摘要 细胞程序性坏死在宿主防御病原体中的作用和调控机制研究 中文摘要 I I PAGE PAGE IV 中文摘要 【研究背景和意义】病原体诱导的细胞死亡是哺乳动物防御系统的一个至关 重要的部分。已经发现 RIP3 依赖的细胞程序性坏死参与到了机体防御外来入侵病 原体的过程中，但病原体激活 RIP3 依赖的细胞程序性坏死的具体分子机制尚不清 楚。 【研究目的】探究 HSV-1 诱导细胞程序性坏死的分子机制，以及这种程序性 坏死方式如何在机体抗病毒中发挥作用。 【研究方法】为了筛选能够引发 RIP3-依赖性细胞坏死的病毒，我们利用两株 牛痘病毒和两株 HSV-1 感染 WT 和 RIP3 缺失的 MEF 细胞，检测细胞的存活率； 为了检测了 RIP3 的缺失是否影响了病毒的入侵和复制，用 HSV-1 感染了野生型和 RIP3 缺失的 MEF 细胞，之后通过蛋白免疫印迹和荧光定量 PCR 检测病毒蛋白和 基因的表达水平。为了检测 RIP3 缺失对 NF-κB 信号通路的影响，利用蛋白免疫 印迹检测 MEF 细胞和 RIP3 缺失的 MEF 细胞感染 HSV-1 后 p-IκBα 水平；为了检 测 TNFR,TLR3，Nectin-1，MLKL，CYLD 和 DAI 是否参与到这条信号通路，通 过对 TNFR1 KO,TNFR1/2 DKO,TLR3 KO 细胞感染 HSV-1 检测存活率，通过 RNAi 沉默 Nectin-1，CYLD 后感染 HSV-1 检测存活率，通过构建 MLKL shRNA 细胞系 和通过 CRISPR/Cas9 技术构建 DAI KO 细胞系，感染 HSV-1 后检测存活率；在 RIP3 缺失的 MEF 细胞上构建能稳定表达 HA 和 Flag 标签的 RIP3 的细胞系，对细胞感 染病毒后，利用 RIP3 的免疫共沉淀，将产物进行质谱分析去寻找参与激活 HSV-1 诱导的细胞坏死的关键作用蛋白；通过逆转录病毒体系使 ICP6 在细胞内过表达以 检测 ICP6 蛋白的表达是否足以激活 RIP3/MLK 依赖的细胞坏死；对野生型小鼠和 和 RIP3 KO 小鼠腹腔注射 HSV-1，检测小鼠脑，脾，肝，血清中的病毒滴度，对 小鼠肝脏进行切片及免疫组化，对小鼠注射一次或两次病毒后，监控存活率，以 此确定 RIP3 在小鼠抵御病毒复制和致病中的作用。 【研究结果】（1）HSV-1 的感染激活 RIP3-依赖性细胞坏死（2）细胞凋亡不 参与到 HSV-1 激活的细胞死亡（3）RIP3 的缺失不影响 HSV-1 入侵细胞以及病毒 中文摘要 细胞程序性坏死在宿主防御病原体中的作用和调控机制研究 自身的复制（4）RIP3 的缺失不影响 HSV-1 激活的 NF-κB 信号活性（5）HSV-1 感染诱发的细胞程序性坏死不依赖 TNFR，CYLD，TLR3，但依赖于 Nectin-1 （6） HSV-1 感染诱发的细胞程序性坏死不依赖于 DAI（7）MLKL 是 HSV-1 感染诱发 的细胞程序性坏死依赖于 RIP3 的底物 MLKL（8）病毒蛋白 ICP6 参与到 HSV-1 激活的 RIP3 免疫复合体中（9）ICP6 与 RIP3 通过 RIP 同源作用域(RHIM)相互作 用（10）ICP6 对于 HSV-1 诱导的细胞程序性坏死是必须的（11）ICP6 的表达足以 激活 RIP3/MLKL 介导的细胞程序性坏死（12）ICP6 激活的细胞程序性坏死依赖 于 ICP6 和 RIP3 的 RHIM 结构域及 RIP3 的激酶活性（13）RIP3 介导的细胞程序 性坏死帮助机体抵御 HSV-1（14）RIP3 介导的细胞程序性坏死帮助宿主抵抗 HSV-1 的复制和造成的致死 【结论】综上所述，我们的工作首次发现了 RIP3 识别 HSV-1 病毒 ICP6 进而 启动宿主细胞程序性坏死的分子机制，并揭示了 RIP3-依赖性细胞坏死在机体抗 HSV-1 病毒感染中的重要生理学功能。 关键词：细胞程序性坏死，HSV-1，ICP6，RIP3，MLKL 作 者：李 沄 指导老师：何苏丹 细胞程序性坏死在宿主防御病原体中的作用和调控机制研究英文摘要 细胞程序性坏死在宿主防御病原体中的作用和调控机制研究 英文摘要 III III PAGE PAGE IV Study on the effect and regulatory mechanism of programmed necrosis in host defense against pathogens Abstract Background and significance: Pathogens induced