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BRAF基因与甲状腺乳头状癌相关性研究 　　摘要：目的 探究BRAF基因及其突变与甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)患者相关参数之间的关系。方法 应用免疫组化、PCR及基因测序技术对92例PTC患者，10例非PTC甲状腺恶性肿瘤患者、59例结节性甲状腺肿患者的新鲜标本进行BRAF蛋白表达情况、BRAF基因突变情况进行检测。分析BRAF基因突变与患者年龄、性别、肿瘤直径、有无颈淋巴结转移、有无包膜、超声征象等临床病理学特征的关系。结果 92例PTC中30例检出BRAF突变基因，而在对照组中未发现相应突变。BRAF基因突变与PTC甲状腺肿瘤直径相关性显著，与性别、发病年龄、有无淋巴结转移等无关。结论 BRAF基因突变与肿瘤直径大小相关性显著，突变可能影响PTC患者远期预后。 　　关键词：甲状腺乳头状癌；BRAF基因突变预后 　　甲状腺癌是最常见的内分泌腺恶性肿瘤，并且其近年的发病率呈现上升趋势，无论是全球范围还是在国内[1]，正逐渐引起研究者的重视。根据肿瘤切除术后的病理结果，我们可以将其分为4个类型：乳头状腺癌、滤泡癌、髓样癌、未分化癌。其中以甲状腺乳头状癌( papillarythyroidcarcinoma，PTC) 的发病率最高，占所有甲状腺恶性肿瘤的80%[2]。鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体基因（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1, BRAF），位于7q23染色体，是RAF基因家族的成员之一。其编码一个由783个氨基酸组成的蛋白，是一种特异性丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞通路RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK中，起到激活MEK/ERK的重要作用，控制细胞的增殖、分化、凋亡等进程[3]。BRAF基因外显子15如果出现单核苷酸突变（T1799A），则其相应的产物蛋白中，谷氨酸取代对应的缬氨酸（V600E），使蛋白成为活化蛋白激酶，激活下游有丝分裂信号，形成肿瘤[4]。经过近几年的研究，人们发现PTC中存在高频率的BRAF突变，并且这种突变与PTC的病因、临床表现、肿瘤细胞生物学行为、病理诊断、治疗策略的选择、近远期预后等方面都具有明显的相关性[5]。本文对本院今年来的PTC患者进行BRAF基因突变检测，并就上述问题进行分析研究，以期对临床治疗具有指导意义。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料实验组：选取2011年1月~2013年6月在本院临床考虑为甲状腺乳头状癌，且行手术切除，并经病理科确诊患者92例。见表1。对照组1：选取2011年1月~2013年6月就诊于本院的患者，具体为7例滤泡癌、2例髓样癌、1例未分化癌。对照组2：同时期于本院诊断为结节性甲状腺肿的患者59例。两组对照组的性别构成、年龄构成与实验组无统计学差异。 　　以上患者诊断皆由本院基本外科甲状腺组教授予临床诊断，由本院病理科教授按WHO标准进行病理诊断。 　　1.2标本处理手术切除肿瘤组织后30min内，由病理科医生从标本肿瘤部位切取肿瘤组织（正常组的标本取自结节性甲状腺肿患者切除肿物周边的正常组织），取大部组织进行石蜡包埋切片，完成病理诊断、免疫组化检测，取部分组织（约0.5×0.5×0.5cm）用于突变基因检测（详见后文），剩余组织用液氮封存于标本管中。 　　1.3试剂实验采用鼠抗人单克隆抗体（克隆号：EPl52Y，购于福建迈新生物有限公司）作为BRAF抗体；免疫组化试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司；PCR反应所用试剂购自北京索莱宝科技有限公司；检测BRAF基因突变所需使用的DNA抽提试剂盒购自北京博凌科为生物科技有限公司。 　　1.4实验方法 　　1.4.1免疫组化采用SABC法，利用PBS代替一抗为阴性对照，采用明确BRAF阳性的大肠癌切片为阳性对照。步骤如下：取4μm厚切片，常规方法脱蜡，加入柠檬酸溶液后煮沸10 min，放至室温，加入3％H2O2甲醇液以失活内源性过氧化物酶，加入BRAF抗体，室温静置5h后用PBS洗涤2次，加入二抗，室温静置2h后用PBS洗涤2次，使用DAB显色，使用苏木精复染，脱水后使用二甲苯透明、使用中性树胶封固。 　　结果判断：显微镜下观察细胞核颜色为棕黄色者即提示BRAF蛋白阳性。依次阅读每一张切片，随机观察10个视野，阳性肿瘤细胞占全体肿瘤细胞总数的百分比≥10%为阳性，反之即为阴性。 　　1.4.2基因突变的检测①DNA的提取：取前文所述标本，根据DNA抽提试剂盒所述步骤，提取DNA于-20℃冰箱保存；②PCR扩增目标片段：引物源自华大基因公司，正向引物5-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3，反向引物5-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3，扩增后目标片段长